💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

Классификация факторов транскрипции

Ниже будут подробнее рассмотрены особенности структуры некоторых наиболее часто встречающихся структурно-функциональных доменов факторов транскрипции и механизмы их регуляторного действия на транскрипцию генов.

Факторы транскрипции в роли позитивных регуляторов (активаторов) синтеза РНК. Изучение механизмов функционирования белковых факторов транскрипции – задача непростая. Прежде всего, это связано с их малой концентрацией в клетках и большими сложностями получения факторов в очищенном состоянии для дальнейших биохимических исследований. Развитие генно-инженерных методов позволило получать факторы транскрипции в неограниченных количествах, что не замедлило принести плоды в виде новой информации (подробнее о методах клонирования генов см. в главе 7).

Для того чтобы фактор транскрипции оказал специфическое действие на синтез РНК определенным геном, он, прежде всего, должен распознать этот ген и связаться с определенной последовательностью ДНК. Затем фактор транскрипции должен взаимодействовать с другими факторами или непосредственно с самой РНК-полимеразой для стимуляции или подавления транскрипции на этом гене. Кроме того, необходимость включения и выключения транскрипции в строго определенных месте и времени (тканеспецифический характер экспрессии генов на разных стадиях онтогенеза организма) предполагает наличие механизмов контроля биосинтеза или активации самих факторов транскрипции для упорядочивания их функционирования. Ниже будут рассмотрены механизмы, обеспечивающие эти три этапа функционирования факторов транскрипции – связывание с ДНК, влияние на процесс транскрипции и регуляция их собственной активности.

Механизмы взаимодействия факторов транскрипции с ДНК. Клонирование генов факторов транскрипции (и их фрагментов), а также выделение соответствующих рекомбинантных белков позволили идентифицировать участки их полипептидных цепей, обеспечивающие специфическое взаимодействие факторов с ДНК. Очищенные фрагменты белков были исследованы на способность взаимодействовать с определенными последовательностями ДНК. Это позволило обнаружить несколько структурных элементов (доменов) полипептидных цепей, общих для факторов транскрипции разных типов, которые легли в основу их современной классификации.

Рис. I.24. Особенности структуры полипептидных доменов типа " цинковые пальцы" и их взаимодействие с ДНК

а – схема строения домена, содержащего Zn-связывающие остатки Cys (C) и Hys (H); б – предполагаемый механизм взаимодействия доменов типа " цинковые пальцы", изображенных в виде цилиндров, с ДНК. Стрелки указывают полярность цепей ДНК 5’®3’; в – схема строения доменов типа " цинковые пальцы", содержащих только Zn-связывающие остатки Cys. Квадратными скобками отмечены участки полипептидных цепей, участвующие в распознавании палиндромных последовательностей ДНК (А и Б)

Домены типа " цинковые пальцы". Одним из первых факторов транскрипции, полученных в виде очищенного рекомбинантного белка, был фактор TFIIIA, который играет ключевую роль в транскрипции генов 5S рРНК РНК-полимеразой III. ДНК-связывающий участок полипептидной цепи этого фактора содержит девять 30-звенных повторов: Tyr/Phe-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa_{2, 4}-Cys-Xaa₃-Phe-Xaa₅-Leu-Xaa₂-His-Xaa_{3, 4}-His-Xaa₅, где Xaa – остаток любой аминокислоты. Таким образом, каждый из повторов содержит две строго консервативные пары остатков Cys и His, которые взаимодействуют с одним ионом цинка. Это приводит к образованию в свернутой полипептидной цепи пространственной структуры, сформированной консервативными остатками Phe, Leu и несколькими остатками основных аминокислот. Структура выступает над поверхностью белковой глобулы в виде " пальца" (рис. I.24, а). Вершины пальцев непосредственно контактируют с большой бороздкой ДНК, причем соседние пальцеобразные структуры связываются противоположными сторонами спирали ДНК (см. рис. I.24, б).

Домены типа " цинковые пальцы" обнаружены у многих факторов транскрипции, обеспечивающих функционирование РНК-полимеразы II, в том числе у фактора Sp1, Kruppel-белка Drosophila, белков ADRI и GAL4 дрожжей и белка аденовируса E1A. Интересно, что точковая мутация в гене Kruppel-белка, приводящая к замене лишь одного из остатков Cys на Ser, что, в свою очередь, предотвращает связывание иона Zn²⁺, фенотипически проявляется как делеция целого гена этого фактора. На данном основании был сделан вывод о том, что способность связывать ионы Zn²⁺ является критической для проявления ДНК-связывающей активности факторов такого типа.

Аналогичные домены обнаружены в полипептидных цепях семейства рецепторов тиреоидных или стероидных гормонов, которые в комплексе с гормонами после переноса в ядра специфически взаимодействуют с определенными последовательностями ДНК, изменяя уровни транскрипции соответствующих генов-мишеней. Однако в этом случае ДНК-связывающие участки состоят из двух пальцев, каждый из которых содержит четыре остатка Cys, взаимодействующие с ионом Zn²⁺_, вместо двух Cys и двух His (см. рис. I.24, в); у них также отсутствуют консервативные остатки Phe и Leu. Кроме того, элемент из двух цинковых пальцев встречается в полипептидных цепях таких рецепторов только один раз, тогда как в генах, кодирующих цинковые пальцы с Cys–His, подобный элемент может повторяться от 2 до 37 раз.

Исследование мест связывания различных рецепторов стероидных гормонов с ДНК показало, что они взаимодействуют с гомологичными, но не идентичными регуляторными последовательностями нуклеотидов (подчеркнуты):

где N – любые нуклеотиды, --- – отсутствие нуклеотидов.

Методами направленного мутагенеза установлено, что специфичность взаимодействия этих рецепторов со своими последовательностями определяется небольшим числом аминокислотных остатков. Так, замена всего лишь двух аминокислотных остатков в N-концевой части цинкового пальца рецептора глюкокортикоидов на аминокислотные остатки, обнаруживаемые в том же самом участке рецептора эстрогенов, приводит к тому, что мутантный рецептор начинает взаимодействовать с регуляторными последовательностями, узнаваемыми рецепторами эстрогенов, и активировать гены, контролируемые этими последовательностями. Аналогичные замены пяти аминокислотных остатков во втором пальце рецептора эстрогенов также приводят к изменению его специфичности: он приобретает способность взаимодействовать с регуляторной последовательностью тиреоидных гормонов. Как уже упоминалось выше, оба рецептора узнают одни и те же последовательности нуклеотидов, различающиеся лишь расстояниями между ними. При этом первый цинковый палец играет ключевую роль в узнавании последовательности как таковой, а второй определяет оптимальное для взаимодействия расстояние между двумя половинками этой последовательности.

Факторы транскрипции, содержащие мотив " спираль–поворот–спираль".Другой тип пептидных доменов, специфически распознающих регуляторные последовательности на ДНК, характерен для белковых продуктов гомеотических (гомеозисных) генов, впервые обнаруженных у дрозофилы. Гомеотические гены позвоночных и растений играют ключевую роль в их морфогенезе. Полипептидные цепи белков, кодируемых этими генами, содержат высококонсервативную последовательность длиной в 60 аминокислотных остатков, называемую гомеобоксом, или гомеодоменом, которая определяет специфичность взаимодействия белков с регуляторными последовательностями ДНК. Анализ третичной структуры гомеодоменов показал, что они образуют структуру типа " спираль–поворот–спираль" (helix–turn–helix), в которой за a-спиральным участком следует b-структура с последующим еще одним a-спиральным участком (рис. I.25, а). Наличие этой пространственной структуры, существование которой было впервые предсказано на основании гомологии с соответствующими аминокислотными последовательностями бактериальных белков-репрессоров, в настоящее время строго доказано методами ЯМР-спектроскопии, в частности для гомеодомена продукта гена Antennapedia дрозофилы.

Рис. I.25. Структуры полипептидных доменов типа " спираль–поворот–спираль" (а) и " лейциновая застежка" (б)

L – остатки Leu

Для бактериальных белков-репрессоров было показано, что при образовании специфических комплексов с ДНК первый a-спиральный участок расположен перпендикулярно большой бороздке ДНК, тогда как второй частично находится в ней и обеспечивает специфические контакты репрессора с операторным участком ДНК. Ключевая роль второго a-спирального участка гомеодомена при изучении специфичности взаимодействия этих белков с ДНК была определена с помощью мутаций. Так, замена только одного остатка Ser в положении 9 a-спирали белка Prd на Gln, присутствующий в гомеозисном белке Ftz, приводит к связыванию белка Prd с Ftz-сайтами на ДНК.

Позднее была обнаружена большая группа регуляторных белков, в которых гомеобоксы формируют лишь одну часть более протяженного консервативного домена, названного POU-доменом. Эти белки, к которым относятся, в частности, октамерсвязывающие белки (octamer binding proteins) Oct-1 и Oct-2, белок гипофиза Pit-1 и продукт гена unc-86 нематод, используют POU-домены для специфического взаимодействия с ДНК. Относительный вклад аминокислотной последовательности гомеобокса и негомебоксной POU-последовательности в специфичность связывания белок-ДНК не одинаков для разных белков. Так, в белке Pit-1 специфичность в основном достигается за счет гомеодомена, тогда как в белке Oct-1 основную роль играет другая последовательность POU-домена.

ДНК-связывающий домен типа " лейциновая застежка". Сравнение аминокислотных последовательностей ряда других факторов транскрипции: фактора транскрипции печени C/EBP, дрожжевого фактора GCN4, а также белков-продуктов протоонкогенов Myc, Fos и Jun (протоонкогены – это гены, мутации в которых могут приводить к злокачественному перерождению клеток), позволило выявить еще одну консервативную аминокислотную последовательность, образующую пространственную структуру, названную " лейциновой застежкой" (leucine zipper). В этой структуре остатки Leu, находящиеся в составе a-спирального участка полипептидных цепей факторов, расположены через каждые шесть аминокислотных остатков на равном расстоянии друг от друга и оказываются на одной стороне a-спирали через каждые два витка (см. рис. I.25, б). Такие домены сами по себе не связываются с ДНК, однако обеспечивают димеризацию содержащих их факторов путем взаимопроникновения лейциновых a-спиралей двух молекул факторов. В результате в димере появляются две правильно расположенные друг относительно друга полипептидные цепи, составленные преимущественно из основных аминокислотных остатков, которые и образуют ДНК-связывающий центр фактора транскрипции.

Димеры белков Fos и Jun связываются с Ap-1-последовательностями ДНК, что сопровождается активацией соответствующих генов в ответ на воздействие форболовыми эфирами. Однако если белок Jun связывается с Ap-1-последовательностями нуклеотидов в виде гомодимера (белкового комплекса, состоящего из двух идентичных полипептидных цепей), то белок Fos специфически взаимодействует с ДНК только после образования комплекса (гетеродимера) с белком Jun. Эти свойства двух белков являются следствием различий в структуре их лейциновых доменов, которые не позволяют образовываться гомодимеру из полипептидных цепей Fos. Искусственная замена лейцинового домена Fos на соответствующий домен белка Jun обеспечивает условия для получения гомодимера из таких химерных полипептидных цепей. Необходимость образования димера этих двух регуляторных белков перед взаимодействием с ДНК создает дополнительную возможность воздействия на экспрессию соответствующих генов путем контроля над формированием самого белкового комплекса фактора транскрипции.

Основной ДНК-связывающий домен, впервые обнаруженный у белков, содержащих " лейциновую застежку", позднее был найден и у ряда других белков, регулирующих транскрипцию, в частности у двух белков E12 и E47, которые взаимодействуют с энхансерами иммуноглобулиновых генов, у регуляторного белка мышц MyoD1 и у некоторых белков дрозофилы. Однако в этих случаях основной домен расположен по соседству с участком полипептидной цепи, образующим домен типа " спираль–поворот–спираль", в котором две амфипатические спирали (содержащие все заряженные аминокислотные остатки на одной стороне спирали) разделены неспирализованной петлей. Предполагают, что такой домен играет ту же роль в димеризации полипептидных цепей и формировании ДНК-связывающего центра, что и описанные выше регуляторные полипептиды, содержащие лейциновые домены.

Следует еще раз подчеркнуть, что структуры типа " лейциновая застежка" и " спираль–поворот–спираль" необходимы для димеризации полипептидных цепей транскрипционных факторов, принадлежащих к данной группе, что сопровождается формированием основного ДНК-связывающего участка регуляторных белков. Белок протоонкогена myc содержит как лейциновый домен, так и домен типа " спираль–поворот–спираль" по соседству с основным ДНК-связывающим доменом. В соответствии с этим все данное семейство регуляторных белков можно разделить на подсемейства, в которых полипептидные цепи факторов транскрипции содержат порознь или одновременно домены типа " лейциновая застежка" или " спираль–поворот–спираль".

Таковы особенности структуры некоторых наиболее хорошо изученных доменов факторов транскрипции, обеспечивающих специфичность взаимодействия последних с регуляторными последовательностями ДНК, что необходимо для их регуляторного воздействия на транскрипцию соответствующих генов. Количество известных доменов у факторов транскрипции быстро возрастает с развитием исследований в этой области. Так, новые ДНК-связывающие участки полипептидных цепей недавно обнаружены у фактора транскрипции AP2, факторов, обеспечивающих регуляторное действие сыворотки, белков CTF/NTF, взаимодействующих с CAAT-боксом, факторов транскрипции дрожжей HAP-2 и HAP-3. В белках существует несколько структур, обеспечивающих специфическое распознавание определенных последовательностей ДНК, что позволяет осуществлять передачу регуляторных сигналов к определенным генам-мишеням и служит основой для обеспечения их дифференциальной экспрессии на уровне транскрипции. Данные о некоторых наиболее важных с функциональной точки зрения доменах факторов транскрипции суммированы в табл. I.14.

Несмотря на то что специфическое связывание с ДНК является обязательным этапом для регуляторного воздействия белковых факторов на транскрипцию, реализация активности факторов часто требует их специфического взаимодействия с другими регуляторными белками, а также с самой РНК-полимеразой II. Большинство таких воздействий приводит к активации транскрипции. Однако результатом некоторых из них может быть и репрессия синтеза мРНК. Ниже будут рассмотрены условия, необходимые для осуществления позитивного действия факторов транскрипции.

Для идентификации участков полипептидных цепей факторов транскрипции, непосредственно участвующих в активации синтеза РНК, чаще всего конструируют химерные рекомбинантные белки (некоторые из них кратко описаны выше), объединяющие в одной цепи ДНК-связывающий домен и участки полипептидных цепей других факторов, и изучают влияние таких гибридных факторов на транскрипцию in vitro. В ходе исследований, основанных на подобных подходах, были идентифицированы функциональные домены факторов транскрипции, в том числе домены, участвующие в активации транскрипции, которые, как правило, отличаются от ДНК-связывающих участков их полипептидных цепей. Доменную структуру факторов транскрипции можно проиллюстрировать на примере семейства рецепторов стероидных/тиреоидных гормонов (рис. I.26). В полипептидной цепи таких факторов четко видны три функциональных модуля: ДНК-

Рис. I.26. Доменная структура полипептидной цепи рецептора глюкокортикоидов

Цифрами указаны номера аминокислотных остатков на границах функциональных доменов, участвующих в активации транскрипции, связывании ДНК и гормона

Таблица I.14