Уреазные методы определения мочевины с использованием сопряженных ферментативных реакций

При этих методах определения мочевины уровень аммиака на втором этапе определяют с использованием сочетанных ферментативных реакций. Наиболее популярный метод определения мочевины в сыворотке крови или моче основан на использовании в качестве индикаторного фермента глутаматдегидрогеназы. При этом на втором этапе происходит преобразование выделяющегося аммиака (ионов аммония) в L-глутамат путем взаимодействия с 2-оксоглутаратом, катализируемого ферментом глутаматдегидрогеназой. Поскольку вторая реакция сопряжена с окислением НАД·Н до НАД+, результаты реакции регистрируют по убыванию оптической плотности раствора при 340 нм. Существуют и некоторые модификации этого метода (используют альфа-кетоглутарат и получают L-глутаминат и др.), но конечный принцип регистрации результатов окисления НАД·Н включен во все указанные методы. Следует отметить, что многие ферменты, содержащиеся в сыворотке крови, способны конкурировать с глутаматдегидрогеназой за кофермент НАДН₂ и вмешиваться в результаты исследования. Кроме того, аммиак, который может содержаться в составе реактивов, может приводить к ложному завышению результатов. Реакция при использовании сопряженной реакции уреаза/глутаматдегидрогеназа, выполненная в кинетическом варианте, может использоваться для определения содержания мочевины в моче при нормальном уровне аммиака, поскольку эндогенный аммиак в моче быстро используется в начале реакции. Последующее изменение поглощения при 340 нм обусловлено образованием аммиака в уреазной реакции.

В другой ферментной системе аммиак, образующийся на первом этапе при участии уреазы, реагирует с глутаматом при участии аденозинтрифосфата (ATФ) в присутствии глутаминсинтетазы. Аденозиндифосфат (АДФ), образующийся в этой ферментативной реакции, определяют с использованием пируваткиназы и пируватоксидазы с образованием перекиси водорода. На заключительном этапе в реакции между пероксидом, фенолом и 4-аминоантипирином при участии фермента пероксидазы образуется окрашенный комплекс. Величину его поглощения оценивают фотометрически.

Был предложен ферментативный метод, основанный на использовании фермента лейциндегидрогеназы, позволяющий избежать вмешательства в реакцию эндогенного аммония. Метод основан на использовании фермента лейциндегидрогеназы, связывающей ионы NH4+ в реакции с образованием L-изолейцина после гидролиза мочевины при участии уреазы. Метод проводят в два этапа. Первый этап — связывание эндогенного NH4+. NH4+, содержащийся в исследуемом образце (сыворотка крови или моча), реагирует с 2-кетоизокапроновой кислотой в присутствии НАДН₂ и лейциндегидрогеназы с образованием L-изолейцина. Второй этап. Определение концентрации NH4+ проводят с помощью той же реакции после добавления в среду инкубации фермента уреазы.

Для определения малых количеств мочевины в биологических жидкостях и микродиализатах был предложен кинетический люминометрический метод. Метод основан на использовании уреазы, расщепляющей мочевину в АТФ-зависимой реакции. Данный фермент катализирует две последовательно протекающие реакции: биотин-зависимое карбоксилирование мочевины (реакция 1) и гидролиз аллофаната, образующегося в первой реакции (реакция 2). Скорость гидролиза АТФ контролируют с помощью люминометра в люциферин-люциферазной реакции. Скорость гидролиза ATФ пропорциональна содержанию мочевины в исследуемом образце. Подобный подход использовался для контроля в реальном времени эффективности гемодиализа.