На тему «Определение пигментов хлорофиллов a и b и сумма каротиноидов».

Лабораторная работа №1

Цели и задачи:

1. Приготовить экстракт пигментов в ацетоне;

2. Определить оптическую плотность 3-х длинных волн:

· 662нм-для хлорофилла а;

· 644нм-для хлорофилла b;

· 478нм-для лютеина(общего содержания каротиноидов).

Для приготовления экстракта существует специальная методика определения пробоотбора: из чистого листа листовой пластинки с помощью пробочного сверла(диаметр может быть любым) вырезают диски, набирающие примерную массу от 0, 2 гр до 0, 3 гр. Диски берутся для того, чтобы знать распределение хлорофилла и площадь образца. Если лист грязный, его необходимо промыть водой и просушить фильтровальной бумагой(в нашем опыте мы использовали готовую пробу лишайника).

Далее пробу заворачивают в фольгу и погружают в жидкий азот. После того, как проба замерзнет, ее отправляют в морозильную камеру с t= -80^о, где она хранится до анализов (при этом условии не происходит разрушение пигментов). Затем пробу переносят в фарфоровую ступку. Для повышения степени диспергирования к пробе добавляют кварцевый песок-одну шпатель-ложку.

В целях предотвращения феофитинизации во время извлечения пигментов к пробе добавляют по одной шпатель-ложке карбоната Са для нейтрализации кислот клеточного сока, и безводного сульфата Na для обезвоживания образца. Для нейтрализации лишайниковых кислот добавляют порциями растворитель ДМСО+Ацетон(2: 1) с помощью дозатора, объем которого равен 2, 0 мм. Далее растираем лишайник до однородного состояния в холодной ступке на льду, чтобы не было разрушения пигментов. После получения смеси, сливаем ее в пробирку, смазывая носик фарфоровой ступки вазилином, чтобы предотвратить потерю полученной смеси.

Следует предотвратить потери пигментов, тщательно обмывая стенки фарфоровой ступки растворителем ДМСО+Ацетон(2: 1) при повторном его добавлении к смеси 2-3 раза до полного обесцвечивания. Объем смеси в пробирке должен составлять 8 мм.

Готовая смесь в пробирке, перед отправлением ее в центрифугу, хранится в темном прохладном месте, так как при свете разрушаются пигменты.

Спустя 5-10 минут, пробирку поместили в центрифугу также на 10 минут при t=+5^о и при 10000 оборотах в минуту.

После центрифуги произвели декантацию, то есть процесс слива осадочной жидкости, в новую пробирку. Осадок остается в старой пробирке. Новую пробирку поместили в темное место. После этого раствор переливают в кюветы, в которых происходит измерение оптической плотности, длина поглощающего слоя равна 1 см. Необходимо 2 кювета: 1) чистый растворитель ДСМА+Ацетон(2: 1); 2)самоионизирующий раствор. Далее кюветы вставляются в спектрофотометр, он пропускает длину волны от 400нм до 700нм.

Если значение оптической плотности раствора при какой-либо длине волны более 0, 9, раствор разбавляют растворителем ДСМА+Ацетон(2: 1) так, чтобы оптические плотности при длинах волн λ ₁=662 нм; λ ₂=644 нм; λ ₃=478 нм соответствовали диапазону оптических плотностей 0, 2≤ А≥ 0, 9.

Рассчитываем массовую концентрацию пигментов в растворах(ρ _i, мг/см³) по формулам:

ρ _а=0, 0117А_{смλ 1}-0, 00216А _{смλ 2};

ρ _b=0, 0218A _{смλ 2}-0, 0038A _{смλ 1};

ρ _k=0, 00426А _{смλ 3}-0, 103ρ _b.

1) Проба № 25:

ρ _а=0, 0117*0, 77-0, 00216*0, 24=0, 0084906мг/см³;

ρ _b=0, 0218*0, 24 -0, 0038*0, 77=0, 002306мг/см³;

ρ _k=0, 00426*0, 79 -0, 103*0, 002306=0, 000237518мг/см³.

2) Проба № 29:

ρ _а=0, 0117*0, 65-0, 00216*0, 19=0, 0071946мг/см³;

ρ _b=0, 0218*0, 19 -0, 0038*0, 65=0, 001672мг/см³;

ρ _k=0, 00426*0, 58 -0, 103*0, 001672=0, 002298584мг/см³.

3) Проба № 31:

ρ _а=0, 0117*0, 72-0, 00216*0, 22=0, 0079488мг/см³;

ρ _b=0, 0218*0, 22 -0, 0038*0, 72=0, 00206мг/см³;

ρ _k=0, 00426*0, 67 -0, 103*0, 00206=0, 00264202мг/см³.

Массы проб:

№ 25=0, 2 гр;

№29=0, 205 гр;

№31=0, 201 гр.

Рассчитываем массовую долю пигментов в растительных материалах(ω _i, %) по формуле:

ω _i =ρ _i*V/m(мг/г), где V=24 мг³ .

1) Проба №25:

ω _а =0, 0084906*24/0, 2=1, 018872=1, 02%;

ω _b =0, 002306 *24/0, 2=0, 27672=0, 28%;

ω _к =0, 000237518*24/0, 2=0, 02850216=0, 029%.

2) Проба №29:

ω _а =0, 0071946*24/0, 205=0, 84229463=0, 84%;

ω _b =0, 001672*24/0, 2=0, 19574634=0, 20%;

ω _k =0, 002298548*24/0, 2=0, 26910252=0, 27%.

3) Проба №31:

ω _а =0, 0079488*24/0, 2=0, 94911045=0, 95%;

ω _b =0, 00206*24/0, 2=0, 24597015=0, 25%;

ω _k =0, 00264202*24/0, 2=0, 31546507=0, 32%.

Вывод: в данной работе был использован метод определения и количественного подсчета пигментов-спектрофотометрический. При этом значения содержания хлорофилла а, хлорофилла b и лютеина получилось больше в пробе №25(Usnea hirta). В пробах №29 (Evernia mesomorpha) и №31 (Evernia mesomorpha) мы получили почти одинаковое количество пигментов.