Основные классы ферментов

Ферментативный катализ существенно отличается от неферментатив­ного, в связи с чем в кинетике ферментативных реакций существуют совершенно особые закономерности. Они позволяют выделить фермен­тативную кинетику в самостоятельный раздел химической кинетики, в котором изучается зависимость скорости реакций, катализируемых фер­ментами, от концентрации реагирующих веществ (ферментов и субстра­тов) и от условий их взаимодействия (температуры, рН, концентрации коферментов и кофакторов, наличия различных эффекторов, т.е. активато­ров и ингибиторов).

Изучение кинетики ферментативного действия имеет важное теоре­тическое значение, поскольку только с позиций кинетики можно подойти к решению вопроса о механизме ферментативного действия. Но оно также необходимо с практических позиций, т.к. только имея определенные сведения о кинетике действия того или иного фермента, можно подо­брать оптимальные условия для его работы, а также влиять на его актив­ность в заданном направлении на различных стадиях технологического процесса.

Вопросы, связанные с кинетикой ферментативных реакций, деталь­но изложены в специальных разделах биохимии и энзимологии, поэто­му основное внимание уделим тем положениям, которые необходимы для грамотного подхода к работе с ферментами: подбору условий для определения активности фермента, определению начальной скорости реакции, выбору субстрата, определению его насыща­ющей концентрации, оптимуму действия температуры и рН, влиянию кофакторов, активаторов и ингибиторов.

Любая ферментативная реакция идет по схеме:

субстрат ®[фермент]® продукт реакции.

Обозначим исходную мольную долю фермента через Х_Е (величина представляет собой общую концентрацию свободного и связанного фермента в любой момент времени), мольную долю субстрата через - Х_S (Х_S> > > Х_Е), мольную долю комплекса фермент-субстрат - через Х_ЕS, мольную долю продукта реакции - через Х_Р. Для математической интерпретации фермент-субстратного взаимодействия используют классическую модель Микаэлиса-Ментена, суть которой заключается в том, что сначала происходит обратимая реакция между ферментом и субстратом, константа скорости которой k₊₁ (для прямой) и k_-1 (для обратной):

Х_Есвоб+Х_S Х_ES

где Х_Есвоб= Х_Е- Х_ES

Затем комплекс ES распадается с образованием продукта Р.

Х_ES Х_Р-Х_E, (3.2)

Следовательно, скорость реакции зависит от констант скорости и концентрации фермента Х_Е и субстрата Х_S. Образование комплекса ES происходит со скоростью _ES.

_ES=k₊₁(Х_E-Х_ES) Х_S-k_-1 Х_ES-k₂ Х_ES (3.3)

В стационарном режиме при _ES=0 имеем:

Х_ES= . (3.4)

Скорость образования продукта реакции:

_ES= k₂Х_ES= , (3.5)

где k₂X_E - максимальная скорость образования продукта реакции.

Отношение (k_-1+k₂)/k₊₁ представляет собой константу Микаэлиса-Ментена, которую обозначим k_M.

Скорость образования продукта реакции является максимальной при условии, что концентрация субстрата очень высока и не является лимитирующим фактором, либо исходная концентрация фермента равна концентрации комплекса. Последнее условие эквивалентно допущению, что k₊₁=∞.

Обозначим максимальную скорость образования продукта реакции через _max. Получаем:

_Р= _max [ X_S/ k_M+X_S ]. (3.6)

Можно показать, что численно константа Микаэлиса-Ментена представляет собой значение концентрации Х_S, для которой _Р= _max.

В более общем виде имеем:

k_M= [ ( _max-Х_Р)/ _Р ] X_S (3.7)

График зависимости _Р от X_S представляет собой гиперболу, для которой одна из асимптот есть _max (рис. 3.1).

Р				Рис. 3.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата согласно модели Микаэлиса-Ментена
max
max
	kM	XS

Таким образом, ход ферментативной реакции во времени не может быть описан одним математическим уравнением, поскольку все фермен­тативные реакции в самом начале своего протекания (когда имеется из­быток субстрата и образовалось мало продуктов реакции) являются реакциями нулевого порядка, и только потом они приобретают характер реакции первого или второго порядка. Скорость реакции нулевого по­рядка со временем не меняется, зависимость количества образовавшего­ся продукта от времени остается прямо пропорциональной (рис. 3.2). Для реакций первого порядка скорость реакции в каждый данный момент времени пропорциональна имеющейся в наличии концентрации субстрата, а следовательно, наблюдается постоянное падение скорости реакции с течением времени (рис. 3.3).

В модели Микаэлиса-Ментена предполагается, что при низких концентрациях субстрата реакцию можно считать реакцией первого порядка относительно субстрата и реакцией нулевого порядка относительно фермента. При высоких концентрациях субстрата она становится реакцией нулевого порядка относительно субстрата и первого порядка относительно фермента; при промежуточных концентрациях субстрата, в частности при значениях X_S≈ k, - реакцией второго порядка.

Хотя изложенная модель очень простая, ее использование приводит к результатам, хорошо совпадающим с экспериментальными. Преимущество модели заключается в том, что она описывает процесс ферментации в любой среде при любой температуре. При этом используются только два параметра: константа k_M и максимальная скорость реакции _max. На практике эти параметры определяют, измеряя скорости реакции для различных концентраций субстрата. В литературе встречаются и другие модели, в которых, в частности, учитываются возможные ингибирующие факторы.

Любой ферментный препарат прежде всего должен быть охарактеризован по его ферментативной активнос­ти. Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует использовать следующие понятия и выражения единиц ак­тивности ферментов:

- стандартная единица активности фермента - такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля дан­ного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Стандартная еди­ница фермента обозначается буквой Е (от русского слова «единица») или буквой U (от английского слова «unit»);

- удельная активность - число единиц (Е или U), отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментном препарате;

- молекулярная активность - число молекул данного суб­страта или эквивалентов затронутых групп, превращаемых за одну ми­нуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации суб­страта (понятие соответствует числу оборотов, введенных Варбургом, т.е. число молей превращен­ного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту;

- катал - каталитическая активность, способная осуществлять ре­акцию со скоростью равной 1 молю в секунду в заданной системе измере­ния активности.

Каталитическая активность в 1 катал (кат) при прак­тическом применении оказывается слишком большой величиной, по­этому в большинстве случаев каталитические активности выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) или пикокаталах (пкат). Стандартная единица фермента находится с каталом в следующем со­отношении: 1 Е (U)=16, 67 нкат.

Для того чтобы правильно определить потенциальные возможности фермента как катализатора, нужно учитывать скорость ферментативной реакции в тот момент времени, когда факторы, замедляющие скорость ферментативной реакции (нехватка субстрата, специфическое ингибирование продуктами реакции, частичная тепловая денатурация фермента и др.), не успевают проявить свое действие и наблюдается прямая пропорциональная зависимость между продуктами реакции и временем. На практике начальную скорость ферментативной реакции определяют графически, для чего строят кривую хода ферментативной реакции во времени. Начальная скорость определяется как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кривой ферментативной реакции.

Многие ферменты катализируют реакции с участием двух субстра­тов. К так называемым бимолекулярным реакциям относятся реакции переноса химических группировок с одного соединения на другое, реак­ции синтеза, окислительно-восстановительные реакции. Такие реакции могут протекать по двум различным схемам. В реакциях первого типа, называемых реакциями единичного за­мещения, два субстрата А и В образуют с ферментом комплекс ЕАВ, который затем распадается с образованием продуктов реакции С и Д. Вто­рой тип двухсубстратных реакций протекает схеме двойного замещения (типа «пинг-понг»). В этих реакциях с актив­ным центром фермента в каждый момент времени связан только один из двух субстратов.

На температурной кривой можно обнаружить снижение скорости ферментативной реакции при температурах, превышающих оптимальную. И это зависит, в первую очередь, от денатурации фер­ментного белка. Именно поэтому очень важным показателем, характеризую­щим отношение фермента к температуре, является его термостабиль­ность. Термостабильность фермента складывается из двух критери­ев: величины температуры и продолжительности ее воздействия на фермент. Кроме того, на термостабильность различных ферментов могут оказывать вли­яние и такие факторы, как рН среды, ее солевой состав, защитное дей­ствие субстрата.

Для каждого фермента харак­терна определенная узкая область значений рН, при которой он прояв­ляет максимальную активность. Форма кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, отражает способность важных для данного фермента протон-донорных или протон-акцепторных групп в активном центре фермента пере­ходить в состояние с требуемой степенью ионизации при определенных значениях рН.

Кроме влияния рН на состояние ионизации активного центра фер­мента, ход представленных кривых будет зависеть и от других факторов. В частности, изменение рН среды изменяет состояние ионизации суб­страта (если это заряженное вещество), комплексов Х_ЕS и Х_ЕР, а в некото­рых, например, окислительно-восстановительных реакциях, ионы Н⁺ сами могут принимать участие в реакции. Помимо этого, скорость дена­турации ферментативного белка зависит от рН.

При экспериментальном изучении активности фермента от рН сле­дует помнить, что рН-оптимум зависит от состава среды (от природы ис­пользуемого буфера); оптимумы рН прямой и обратной реакции могут быть совершенно различными; при действии одного и того же фермента на различные субстраты рН-оптимумы также могут быть различными.

Кроме понятия оптимума рН, очень важным является понятие рН-стабильности. Это тот диапазон рН, при котором фермент или фермента­тивный препарат сохраняет свою активность в течение определенного периода времени. рН-стабильность также зависит от ряда факторов, сре­ди которых, кроме уже названных, форма ферментного препарата, сте­пень его очистки и др. Все вышеизложенное позволяет утверждать, что варьируя температур­ный режим и изменяя рН, можно в какой-то мере регулировать катали­тическую активность фермента.

В ферментативных реакциях большое значение играют активаторы и ингибиторы процесса. Активаторами называют вещества, которые повышают активность ферментов. Хорошим приме­ром таких соединений являются аминокислота цистеин и восстановлен­ный глютатион, содержащие свободную SН-группу. Их активирующее действие заключается в том, что они восстанавливают дисульфидные свя­зи с образованием SН-групп, необходимых для проявления каталитичес­кой активности тиоловых ферментов. Кроме того, некоторые ферменты активируются металлами, которые либо участвуют в построении актив­ного центра, либо стабилизируют пространственную конформацию фер­ментного белка и, тем самым, обеспечивают проявление каталитических функций.

Ингибиторами называют вещества, специфически снижающие активность ферментов. Снижение или полная потеря активности фер­ментов могут быть вызваны разного рода денатурирующими воздействи­ями. В этом случае правильнее употреблять термин «инактивация» фер­мента. Механизм действия ингибиторов может быть самым разнообразным:

- ингибитор взаимодействует с апоферментом, при этом возможны такие варианты, как связывание функциональных групп белка, измене­ние третичной и четвертичной структуры апофермента, специфическое связывание с определенным участком апофермента, неспецифическая адсорбция на белке;

- ингибитор образует комплекс с субстратом;

- ингибитор связывает кофермент;

- ингибитор связывает активатор;

- ингибитор связывает кофактор.

В свое время Эмиль Фишер, говоря о том, что субстрат подходит к ферменту как «ключ к замку», предполагал, что активный центр фермен­та имеет совершенно жесткую структуру, комплементарную структуре субстрата. В развитие представлений Э. Фишера американский исследо­ватель Д. Кошланд выдвинул теорию «индуцированного соответствия». Ее суть заключается в следующем. Пока фермент не вступает во взаимо­действие с субстратом, структура его активного центра лишь приблизи­тельно комплементарна структуре субстрата; их полная комплементарность наступает лишь в момент их взаимодействия т.е. индуцируется взаи­модействием. Таким образом, выводы Э. Фишера о жестком соответствии структуры фермента и субстрата заменяются на представления о гибких, эластичных активных центрах молекул фермента. Теория Кошланда под­разумевает, что конформация молекулы фермента и его активного цент­ра может изменяться под влиянием коэнзима и субстрата.

Экспериментальные данные, полученные для ряда ферментов, сви­детельствуют о том, что в результате присоединения фермента к субстрату про­исходит изменение ряда физико-химических показателей ферментно­го белка.

В настоящее время выделяют четыре основных фактора, определяю­щие каталитическую активность ферментов.

1. Сближение и ориентация субстрата по отноше­нию к каталитической группе. Другими словами, фермент способен связывать молекулу субстрата таким образом, что атакуемая связь располагается вблизи от каталитической группы и правильно ори­ентируется относительно нее в пространстве.

2. Напряжение и деформация: индуцированное соответствие. Присоединение субстрата может вызвать конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к напря­жению структуры активного центра, к некоторой деформации связанно­го субстрата, облегчая тем самым достижение комплексом Х_ЕS необходи­мого состояния.

3. Общий кислотно-основной катализ. В активном центре фермента могут находиться группы специфических аминокислот­ных остатков, которые являются хорошими донорами или акцепторами протонов. Такие кислотные или основные группы представляют собой мощные катализаторы многих органических реакций, протекающих в водных системах.

4. Ковалентный катализ. Некоторые ферменты реагируют со своими субстратами, образуя очень нестабильные, ковалентно связан­ные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе последующей реакции образуются продукты реакции.

Перечисленные выше четыре фактора, по-видимому, вносят различ­ный вклад в ускорение химических реакции ферментами различных ти­пов. Эти факторы реализуются в разных ферментах в разных сочетаниях, и в результате механизм действия каждого фермента уникален.

В различных пищевых технологиях долгое время применялись лишь препараты свободных ферментов, срок использования которых - один производственный цикл. Однако достижения молекулярной биологии, биохимии и энзимологии привели к тому, что в настоящее время строе­ние и функции многих ферментов изучены очень детально, и это позво­лило создать теоретическую базу для производства ферментов пролон­гированного действия или иммобилизованных ферментов, т.е. связанных ферментных препаратов.

Сущность иммобилизации ферментов заключается в присоединении их в активной форме тем или иным способом к инертной матрице (обыч­но это нерастворимый полимерный носитель). Иммобилизацию фермента можно определить и как включение мо­лекулы фермента в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться находящимися в ней молекулами субстрата, эффектора или кофактора.

Фаза фермента обычно нерастворима в воде и часто представляет со­бой высокомолекулярный гидрофильный полимер, например, целлюлозу, полиакриламид и т.д. Включение фермента в изоли­рованную фазу осуществляют различными способами: фермент может быть ковалентно связан с этой фазой, адсорбирован на ней или физичес­ки включен в нее.

Возможны следующие способы иммобилизации фермента.

1. Ковалентное связывание. Молекула фермента ковален­тно связывается с нерастворимым полимером. Полимер может быть в виде порошка или в форме пленки. Иногда молекулы фермента соеди­няются ковалентными связями друг с другом или с каким-либо инерт­ным белком; при этом образуется нерастворимый, но активный поли­мерный фермент.

2. Электростатическое связывание. Этот способ иммо­билизации основан на использовании электростатических или других нековалентных механизмов связывания.

3. Сополимеризация с помощью многофункцио­нальных реагентов. Связывание молекул фермента с белками (на­пример, с альбумином) или друг с другом осуществляется за счет исполь­зования определенных реагентов. В качестве такого многофункциональ­ного реагента часто используют глутаровый альдегид, гелеобразующее действие которого известно давно. В этом способе необходимо избегать взаимодействия реагента с активным центром фермента и ингибирования последнего.

4. Включение в полимер. В этом способе фермент не при­креплен к полимеру, но удерживается внутри него, поскольку последний образует вокруг фермента сетеобразную матрицу Ячейки этой матрицы настолько малы, что молекула фермента не может освободиться из сети, но в то же время достаточно велики для проникновения низкомолекуляр­ных субстратов. Примером такого способа иммобилизации могут служить:

- включение в липосомы, когда фермент находится в водном раство­ре, окруженном фосфолипидным барьером;

- гидрофобное взаимодействие, когда фермент «погружен» в гидро­фобную часть двойного липидного слоя.

5. Инкапсулирование. Включение фермента в органическую или неорганическую капсулу, которая представляет собой полупроница­емую мембрану.

Выбор способа иммобилизации фермен­тов определяется обоснованием подходящего метода. Этот выбор определяется целым рядом факторов, многие из которых невозможно вы­явить до тех пор, пока метод не будет опробован. Первичный отбор осуществляется обычно эмпирическим путем. Сна­чала нужно решить, необходим ли для прикрепления фермента специфический носитель, не будет ли процедура иммобилизации инактивировать фермент и сможет ли иммобилизованный фермент действитель­но функционировать в тех условиях, при которых его предстоит использо­вать, именно поэтому для успешной иммобилизации следует по возможности при­нять во внимание следующие факторы:

- фермент должен быть стабильным в условиях реакции;

- реагенты, образующие поперечные сшивки, не должны взаимодейство­вать с химическими группировками активного центра. В связи с этим молекула поперечно-сшивающего реагента должна быть как можно больших раз­меров, что будет препятствовать его проникновению в активный центр;

- всегда, когда это осуществимо, необходимо тем или иным способом защищать активный центр фермента (например, обработка тиоловых ферментов глютатионом или цистеином);

- процедура промывания для удаления «непришитого» фермента не дол­жна оказывать влияния на иммобилизованный фермент;

- полимерная матрица не должна являться субстратом для иммобили­зованного фермента;

- необходимо учитывать механические свойства носителя, осо­бенно его механическую прочность и физическую форму.

Ферменты животного происхождения выделяют из органов, в которых интенсивно протекают биохимические процессы. Из слизистой желудка получают пепсин, из поджелудочной железы свиней получают смеси трипсина, химотрипсина, липаз и амилаз. Из ферментов растительного происхождения наиболее широко в народном хозяйстве используют амилазы и протеазы.

Трудоемкость и ограниченность ресурсов для получения животных и растительных белков, а также сезонные ограничения (для растительных ферментов) вызвали необходимость изыскания новых способов получения ферментов. Современные методы генетики и генной инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимых ферментов, получаемых микробиологическим путем. Кроме того, среди микроорганизмов можно найти формы, живущие в экстремальных условиях (термофилы, мезофилы). Это обусловливает то, что можно выделить ферменты с улучшенными свойствами: термостабильные, осмоустойчивые и т.д.

Микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов представляют особый интерес, поскольку их метаболизм, а, следовательно, и работа ферментных систем осуществляется с высокой скоростью. Многие микроорганизмы выделяют ферменты, которые в большом количестве мигрируют в культуральную среду. Основными промышленными микроорганизмами для производства ферментных препаратов являются плесневые грибы Aspergillus oryzae, Asp. awamori, Asp. niger и др. Они являются активными синтезаторами амилолитических, протеолитических, пектолитических и других ферментов. Аналогичной способностью обладают бактерии видов Bac. mesentericus и др. Способностью активно продуцировать целлюлитические ферменты обладают представители ряда несовершенных грибов родов Alternaria, Trichoderma, Fusarium и др.

С технологической точки зрения очень важно то, что микроорганизмы выделяют ряд ферментов из клеток в окружающую среду. Это существенно облегчает их выделение и чистку. Важным требованием к применяемому продуценту является его способность к образованию большого количества какого-либо одного фермента при незначительном количестве другого фермента. Выделение ферментов из биомассы является сложным процессом. В его основу положены разнообразные методы, использование которых зависит от свойств выделяемого фермента. К подобным методам относят высаливание, осаждение под действием растворителей, высокомолекулярных соединений, температуры или ионов Н⁺, металлов.

В производстве ферментных препаратов используются комплексные среды, являющиеся смесью синтетических сред с естественными материалами растительного, животного и микробного происхождения.

Применяют два способа выращивания продуцентов ферментов: поверхностный (предусматривает выращивание микроорганизмов, главным образом плесневых грибов на поверхности твердых, полужидких или сыпучих материалах, и создает хорошие условия для максимального контакта микроорганизмов с кислородом воздуха) и глубинный (предусматривает выращивание микроорганизмов на жидких средах при использовании в качестве продуцентов ферментов микроорганизмов, способных интенсивно развиваться в условиях недостаточного контакта клеток с кислородом).

Синтетические среды готовят из различных минеральных солей и органических соединений, являющихся источником углерода, - углеводов, спиртов, органических кислот. В качестве естественных материалов применяются отходы пищевых производств: отруби, меласса, жмыхи, кукурузный экстракт, солодовые ростки, пивные дрожжи, зерно-картофельная барда и др. Для накопления ферментов в культуральной среде необходимы оптимальные условия для их синтеза; оптимальный состав среды; температуру; значение рН, снабжение клеток кислородом воздуха, удаление продуктов обмена.

При поверхностном способе выращивания ферменты из питательной среды экстрагируют водой, отделяют от твердой фазы, сгущают до концентрации сухих веществ 50 %. При глубинном культивировании отделяют клетки микроорганизмов от культуральной жидкости фильтрацией или центрифугированием. Фильтрат или центрифугат сгущают до концентрации сухих веществ 40 %. Полученные таким образом концентраты ферментов представляют собой технические ферментные препараты, которые могут использоваться в жидком виде или после высушивания в виде порошка. Для очистки ферментов применяется осаждение их из водных растворов органическими и неорганическими растворителями (метиловым эфиром, изопропиловым спиртом, ацетоном, сульфатами аммония, натрия, цинка, хлоридом натрия). Высушивание предварительно очищенных и сконцентрированных препаратов осуществляют в распылительных сушилках или методом сублимации.

Ферментные препараты представляют собой концентраты ферментов, полученные с помощью микроорганизмов, содержащие в своем составе наряду с ферментами балластные вещества. Выпускают ферментные препараты в виде жидкостей с концентрацией сухих веществ не менее 50 %, либо порошков белого, серого или желтого цвета, имеющих определенную ферментативную активность. Ферментные препараты применяются в производствах как катализаторы соответствующих биохимических процессов.