Хід роботи. Для проведення занять отримують клітинну масу донорного штаму

Для проведення занять отримують клітинну масу донорного штаму

Bacillus subtilis 23. Бактерії вирощують на глюкозо-сольовому середовищі (або

середовищі Спіцайзена) з доданням бульйону Хоттингера (10%).

5 мл середовища в пробірці 22 200 мм висівають культурою донорного штаму, узятої зі свіжого розсіву на чашці або пробірці з агаризованим бульйоном Хоттингера. Бажано, щоб концентрація бактерій в інокуляті становила приблизно 105 клітин/мл. Пробірку вміщують на качалку при температурі 37 °С на 18 год. Після цього порції по 1 мл отриманого посівного матеріалу переносяться в колби на 0, 75 л з 50 мл прогрітого середовища. Загальну кількість висіваної культури, готують з розрахунку 20 мл на одного студента. Культури вирощують на качалці при температурі 37 °С у протягом 10

– 12 годин.

Бактерії з усіх колб збирають центрифугуванням на холоді (– 4 °С) при частоті обертання 6000 об/хв протягом 10 хв (або при частоті обертання 3000 об/хв протягом 20 – 30 хв). Осад ресуспендують у 50 – 100 мл холодного ССР і повторно центрифугують. Потім отриманий осад промивають таким само чином у холодному ССР.

Процедуру центрифугування й промивання бактеріальних клітин проводять без дотримання стерильності.

Промиту біомасу (у вигляді осаду) донорного штаму готують безпосередньо до першого заняття.

Якщо буде потреба, біомасу можна отримувати завчасно й зберігати до початку заняття в замороженому стані.

1. Для виділення ДНК (не стерильно) промиту біомасу донорного штаму, зібрану з 20 мл культури, суспендують в 1 мл БР І у пробірці місткістю 10 – 20 мл із притертою пробкою (рис. 4). Для проведення експерименту потрібна невелика кількість ДНК; досить виділити препарат із клітин, зібраних з 20 мл культури, тому що з невеликої кількості біомаси (зібраної з об'єму культури меншого, ніж 5 мл) важко отримати добре сформований осад (" медузу") ДНК. Можна виділити препарат з біомаси, зібраної з 100 мл культури, збільшивши об'єм всіх використовуваних розчинів у п’ять разів порівняно з кількостями, наведеними у прописі. Виділеної при цьому ДНК із надлишком вистачить на проведення багатьох експериментів.

2. До суспензії додають 1 мл БР І, що містить лізоцим у концентрації 2 мг/мл. Суміш інкубують при температурі 37 °С протягом 30 – 60 хв, періодично перемішуючи.

3. Після закінчення інкубації в суміш вносять 0, 5 мл 5 % розчину ДДС й витримують при температурі 37 °С 10 хв При цьому відбувається бурхливий лізис біомаси, супроводжуваний різким збільшенням в’язкості. Лізат ретельно розмішують скляною паличкою, після чого до нього додають 2, 5 мл БР ІІ.

4. Далі проводять депротеїнізацію ДНК: до лізату додають рівний об'єм (5 мл) суміші хлороформ – октиловий спирт, ХОС (9: 1) або суміші хлороформ – ізоаміловий спирт, ХІС (24: 1). Суміш інтенсивно струшують 30 хв, потім переносять у центрифужну пробірку й центрифугують при частоті обертання 10000 об/хв 15 хв Після центрифугування верхній водний шар відбирають пастерівською піпеткою (або звичайною піпеткою з розширеним кінцем) і переносять у хімічну склянку місткістю 50 – 100 мл. Зручно користуватися піпеткою, з'єднаною гумовою трубкою зі шприцом, закріпленим у затискачі фізичного штатива. Відбирання слід робити обережно, не захоплюючи денатурований білок на межі поділу фаз.

5. До зібраної водної фази доливають два об'єми холодного (0 °С) 96 % етанолу. Утворений осад ДНК намотують на тонку скляну паличку, притискають до стінки склянки, віджимачи від спирту, промивають у двох порціях 70 % етанолу для видалення слідів детергенту. Потім знову віджимають від спирту й переносять осад у пробірку із притертою пробкою, що містить 1, 8 мл суміші хлороформ–ССР (1: 10). Пробірку поміщають на ніч у холодильник для розчинення ДНК.

Промита біомаса з 20 мл

культури клітин

Ресуспендувати в 1 мл БР І Суспензія клітин

Додати 1 мл БР І з 2 мг/мл лізоциму,

інкубація 30–60 хв при 37 єС і перемішуванні Суспензія сферотопластів

0, 5 мл 5% ДДС й витримують при 37 °С, перемішувати скляною паличкою 10 хв. Лізат клітин

Додати 2, 5 мл БР ІІ Забуферений лізат клітин

Додати 5 мл ХОС (9: 1) або ХІС (24: 1),

суміш інтенсивно струшують 30 хв. Суміш

Центрифугування при 10000 об/хв. 15 хв., відібрати верхній водний шар

Водна фаза

Віджати від спирту, додати 1, 8 мл хлороформ- ССР (1: 10), витримати 4 °С, 12 год

Додати 0, 1 мл 10 ССР,

1 мл 0, 4 мг/мл розчину РНКази

Розчин ДНК з РНКазою

Повторна депротеїнізація

та центрифугування, осадження 96 % і промивання 70 % етанолом Осад очищеної ДНК

Рис. 4. Виділення ДНК з Bacillus subtilis 23

Після розчинення ДНК у пробірку додають 0, 1 мл десятикратного ССР

й 0, 1 мл розчину панкреатичної РНК-ази в концентрації 0, 4 мг/мл (бактеріальна ДНК дуже повільно розчиняється у ССР). Тому зручніше спочатку розчинити її

в розведеному в 10 разів ССР, а потім уже довести концентрацію солей у препараті додаванням десятикратного ССР). Суміш інкубується при температурі 37 °С протягом 30 хв. Після охолодження до неї додають рівний об’єм суміші ХОС (або ХІС) і проводять депротеїнізацію препарату, як описано вище. Якщо після поділу фаз проміжний шар містить багато денатурованого білка, після відбирання водної фази до неї слід додати нову порцію суміші ХОС і знову провести депротеїнізацію (звичайно при очищенні препаратів ДНК за допомогою хлороформ-спиртової суміші процедуру депротеїнізації повторюють не менш чотирьох разів).

7. Далі суміш переносять у центрифужну пробірку, центрифугують при частоті обертання 10000 об/хв 30 – 60 хв, верхню водну фазу відбирають, охолоджують і ДНК осаджують двома об'ємами холодного 96 % етанолу. Осад ДНК промивають двома об'ємами 70 % етанолу й зберігають у 70 % етанолі в холодильнику при температурі 4 °С.

Контрольні запитання

1. Що означає термін ― плазміда‖?

2. Де в клітині розташовуються плазміди й епісоми? У чому їхня

схожість і відмінність?

3. Які існують методи руйнування клітин?

4. Як отримують ДНК за методом Савули і Кроуфорда?

5. Як зберігають препарат ДНК?

ЛІТЕРАТУРА:

1. Конспект лекцій.
2. «Медична біологія» за редакцією В.П.Пішака, Ю.І.Бажори. 2004 р., стор. 183-185, 203-215.
3. „Біологія” А.О.Слюсарєв, С.В.Жукова, 1992 р., стор. 115-117, 121-137.
4. „Биология” А.О.Слюсарев, С.В.Жукова, 1987 г., стор. 117-120, 134-140.