Визначення активності лужної фосфатази в сироватці крові

Лужна фосфатаза (фосфогідролаза моноефірів ортофосфорної кислоти) є цинковмісним металопротеїном, який бере участь у мінеральному обміні. Вона розщеплює ефіри ортофосфорної кислоти з утворенням неорганічного фосфору. Крім кісткової тканини, лужна фосфатаза міститься у печінці, кишечнику, нирках і плаценті. Сироваткова лужна фосфатаза має змішане походження: кістково-печінково-кишкове. У молодняку великої рогатої худоби переважає кістковий ізофермент, а кишковий знаходять лише при патології. У кістках фермент синтезується остеобластами.

Принцип визначення. При інкубації сироватки крові з бета-гліцерофосфатом лужна фосфатаза розщеплює субстрат з утворенням неорганічного фосфору. З отриманого результату вираховують кількість неорганічного фосфору, визначеного в паралельній пробі. Отримана різниця характеризує активність ферменту. Визначається вона в одиницях Боданські (1 од. дорівнює 1 мг/100 мл неорганічного фосфору).

Обладнання та реактиви: визначення активності лужної фосфатази проводиться одночасно з визначенням кількості неорганічного фосфору, тому необхідні ті самі реактиви. Додатково використовується термостат (краще ультратермостат) та робочий розчин бета-гліцеро-фосфату. З метою економії реактиви готують безпосередньо перед роботою (табл. 17).

Таблиця 17 – Схема приготування робочого розчину бета-гліцерофосфату

Методика визначення. При роботі з використанням 1 %-ного розчину аскорбінової кислоти послідовно виконують наступні дії:

– нагрівають у водяній бані лужний розчин бета-гліцерофосфату при температурі 37 °С 5 хвилин;

– у центрифужні пробірки (П₁) вносять 0, 2 мл сироватки крові і швидко додають 2 мл підігрітого розчину бета-гліцерофосфату;

– пробірки (П₁) ставлять на 1 год у термостат при температурі 37 °С. В подальшому у них проводять визначення лужної фосфатази;

– через 1 год пробірки (П₁) виймають з термостату і відразу ж у кожну додають 2, 2 мл 10 %-ного розчину трихлороцтової кислоти. Після струшування вміст пробірок через кілька хвилин центрифугують при 1500 об/хв протягом 10 хвилин;

– до 1, 5 мл центрифугату додають 1 мл молібденового реактиву і 1 мл 1%-ного розчину аскорбінової кислоти. Рівно через 10 хв проби колориметрують на КФК-2 чи КФК-3 при довжині хвилі 660 нм в кюветі з товщиною робочого шару 0, 5 см.

Отриману при колориметрії оптичну щільність проб, у яких визначається неорганічний фосфор, віднімають від оптичної щільності паралельних проб, в яких визначалась активність фосфатази. Потім за тією самою калібрувальною кривою чи таблицею знаходять активність ферменту.

Клінічне значення. Активність фосфатази у сироватці крові здорового молодняку великої рогатої худоби складає 1–5 од. Боданські або 5, 35–26, 75 ммоль/л за хвилину. Підвищення активності ферменту у сільськогосподарських тварин діагностують на ранніх стадіях рахіту. У синовіальній рідині молодняку активність ферменту особливо помітно підвищується при порушенні обміну фосфору та А-гіповітамінозі. Визначення активності лужної фосфатази допомагає диференціювати деякі форми остеодистрофії. При остеомаляції показники активності ферменту підвищені, при остеопорозі – у межах норми.

Активність лужної фосфатази може збільшуватися при захворюваннях печінки (гепатит, гепатодистрофія, злоякісні пухлини), проте у цих випадках збільшується вона в основному за рахунок печінкового, а інколи і кишкового ізоферментів. Тому слід визначати ступінь термоінактивації ферменту. Сироватку крові нагрівають при 56 °С протягом 15 хв,
а потім визначають загальну активність ферменту і паралельно в підігрітій сироватці крові – активність термостабільних ізоферментів (печінкового і кишкового). При рахіті ступінь термоактивації не менший
75 %, а при хворобах печінки коливається у межах 40–75 %.