Приложение 3. Методы определения ферментативной активности бактерий

П о с т а н о в к а р е а к ц и и н а о к с и д а з у

На поверхность питательной среды в чашку Петри на участок, откуда была взята для отсева подозрительная на менингококк колония, наносят каплю свежеприготовленного 1-процентного водного раствора хлористо­водородного диметилпарафенилендиамина. Все представители рода нейсерий под действием реактива розовеют, а затем чернеют и гибнут. Указанный реактив может быть заменен диэтилпарафенилендиамином или диметилфенилендиамином, коммерческим реактивом для постановки оксидазного теста.

П о с т а н о в к а р е а к ц и и н а к а т а л а з у

Реакцию производят путем нанесения одной капли 3-процентного и 10-процентного свежеприготовленного раствора перекиси водорода из пергидроля на поверхность посева исследуемой культуры. Появление на поверхности посева пузырьков газа свидетельствует о положительной реакции.

В случае отсутствия активности при нанесении перекиси на культуру следует провести реакцию на предметном стекле, смешав культуру с кап­лей перекиси. Эту пробу нельзя ставить с культурой, растущей на кровя­ном агаре, так как наличие в этом субстрате фермента каталазы может дать ложную положительную реакцию. В таких случаях реакцию ставят на предметном стекле в капле перекиси.

О п р е д е л е н и е у р е а з ы п о м е т о д у З а к с а

Готовят раствор А: спирт 96 ° - 2 мл, дистиллированная вода — 4 мл, мочевина — 2 г. Готовят раствор В: КН2РО4 — 0, 1 г, К2НРО4 — 0, 1 г, NaCL - 0, 5 г, фенол-рот 0, 2-процентный — 1 мл, дистиллированная вода — до 100 мл.

Раствор А автоклавируют в течение 30 мин при 1, 5 атм. Смешивают 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают по 0, 1 мл в агглютинационные пробирки (стерильно) и вносят несколько капель ис­пытываемой культуры. Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При наличии у бактерий фермента уреазы среда приобретает ярко-малиновое окрашивание, при отсутствии — цвет среды не изменяется.

Общее время наблюдения за реакцией до 18—24 ч (при отрицательной реакции).

ß - г а л а к т о з и д а з н а я а к т и в н о с т ь О N Р G

ß -галактозидазную активность гемофильных бактерий можно опре­делить либо с помощью коммерческих импрегнированных дисков, либо в среде, содержащей О N Р G. При отсутствии в лаборатории реактивов О N Р G, ß -галактозидазная активность может быть определена по расщеплению агара, содержащего 5 % лактозы.

Приготовление среды: 6 г О N Р G растворяют в 1000 мл 0, 01 М NаНРО4 рН = 7, 5, стерилизация фильтрацией через фильтр Зейтца. Хранить в рефрижераторе. Стерильно добавляют 250 мл среды О N Р G к 750 мл пептонной воды и разливают по 2 мл в пробирки. Среду хранят один месяц. Пробирки со средой засевают взвесью испытываемых микро­бов и инкубируют 24 ч (учет реакции начинают вести через 14 мин инку­бации). Положительную реакцию определяют по появлению ярко-желто­го окрашивания за счет О-нитрофенола.

При использовании импрегнированных дисков в пробирку с 0, 3 мл физиологического раствора рН=7, 24-7, 4 вносят петлей суточную куль­туру, затем помещают индикаторный диск. Инкубируют посев в термо­стате при температуре 37 °С. Предварительный учет производят через 1 ч, окончательный через 18-24 ч. При положительном результате бес­цветный диск приобретает желтую окраску. В качестве контроля исполь­зуют пробирку с физиологическим раствором и диском. ß -галактози-дазной активностью или расщеплением агара с 5 % лактозы обладают все гемофилы, за исключением Н. influenzae.