Культивирование и индикация вирусов

Культивирование вирусов человека и животных проводят:

с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций,

для изучения патогенеза и иммунитета при вирусных инфекциях,

для получения диагностических и вакцинных препаратов.

Вирусы культивируют трех биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) и в культурах клеток (тканей).

Выращенные вирусы определяют с помощью методов индикации и идентификации. Индикация, т.е. обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками. Идентификация (определение вида, типа) вирусов осуществляется, в основном, с помощью иммунологических реакций, основанных на взаимодействии антигенов вирусов и соответствующих им АТ.

Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально) и в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма затруднено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними вирусами, а также по экономическим и этическим соображениям.

В некоторых случаях биологический метод может явиться единственным в диагностике вирусных инфекций (б о льшая часть медленных вирусных инфекций), а также для получения чистых культур вируса (вирусы Коксаки, ECHO, лимфоцитарный хориоменингит и др.); или как дополнительный метод исследования при диагностике (заражение в роговицу для определения наличия герпесвируса и исследуемом материале).

При использовании биологического метода с целью диагностики заболевания необходимо знать, что определенные вирусы культивируются на определенных экспериментальных животных и при определенном способе заражения и сроке введения материала. Например, при диагностике некоторых медленных вирусных инфекций заражение проводят у постели больногоинтрацеребральномышатам-сосункам (1-2 суточным), т.е. здесь имеет значение вид животного, возраст животного, время от забора до введения материала и способ введения материала (заражения).

Экспериментальные животные в вирусологии применяются для следующих целей:

диагностики вирусных инфекций (выделение, накопление, типирование и титрование вирусов);

получения иммунных противовирусных сывороток и ингреди­ентов крови (эритроцитов, лейкоцитов, плазмы и т.д.);

моделирования вирусных инфекций для изучения патогенеза, иммунитета, патоморфологии и т.д.;

разработки способов специфической и неспецифической про­филактики и лечения.

О продукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, патологическим изменениям органов, и а также на основании реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы.

Куриные эмбрионы (5—12-дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать виру­сы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возмож­ность накопления вирусов в больших коли­чествах; отсутствие скрытых вирусных ин­фекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, крово­излияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, получен­ной из полостей зараженного зародыша.

Методику культивирования вирусов в раз­вивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эм­брионах птиц; почти неограниченные возмож­ности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток.

Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получивши­ми за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и дру­гих биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культу­ры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более актив­ной способностью к росту и размножению.

При выращивании культур клеток необхо­димо выполнение ряда условий:

1) соблюдение правил асептики;

2) исполь­зование лабораторной посуды из нейтрально­го стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения био­технологической продукции;

3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные рас­творы для поддержания стабильного рН;

4) до­бавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов;

5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38, 5 °С) роста клеток.

В зависимости от техники приготовления различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток:

Однослойные культуры клеток — клетки спо­собны прикрепляться и размножаться на повер­хности химически нейтрального стекла лабора­торной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии.

Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во враща­ющемся барабане. Их используют для получе­ния большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин.

Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются огра­ниченно).

Культуры клеток в процессе их культиви­рования способны проходить десятки гене­раций. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: 1) пер­вичные, или первично-трипсинизированные; 2) перевиваемые, или стабильные; 3) полупе­ревиваемые.

Первичные культуры способны размножать­ся только в первых генерациях, т. е. выдержи­вают не более 5—10 пассажей после выделения из тканей. В основе получения первичных культур лежит обработка кусочков тканей (эм­бриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, например трипсином, который разрушает межклеточ­ные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток.

Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лаборатор­ных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают мно­гочисленные пассажи. Их получают преиму­щественно из опухолевых или эмбриональ­ных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культура­ми. К ним относятся: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном со­стоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злока­чественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клет­ками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида куль­тур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин.

Полуперевиваемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40—50 пассажей. Их обычно по­лучают из диплоидных клеток эмбриона че­ловека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, ха­рактерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественной трансформации. Поэтому полуперевиваемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин.

Штаммом диплоидных клеток называется морфологически однородная культура клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста (стабилизации, активного роста и старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной активностью при трансплантации хомячкам.

Внедрение в вирусологию метода культур клеток позволило выделить и идентифициро­вать многочисленные ранее неизвестные ви­русы, так как почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие чувствительные клетки, в которых он способен репродуциро­ваться. Метод дал возможность изучать взаи­модействие вирусов с клеткой на молекуляр­ном уровне, получать высококачественные вакцинные и диагностические препараты, проводить вирусологические исследования в стандартных условиях.