Лекция 4

Рибонуклеин қ ышқ ылы, ДНҚ -РНҚ гибридтелу.

Жоспары:

1.Рибонуклеин қ ышқ ылы (РНҚ).

2.РНҚ -ның қ ұ рылымы жә не қ асиеттері: ақ параттық, рибосомдық жә не тасымалдаушы РНҚ.

3. Нуклеин қ ышқ ылдарының молекулалық гибридтелуі жә не ренатурациясы.

4.ДНҚ -РНҚ гибридтелу.

5.Молекулалық гибридизация негізінде ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегінің ұ қ састығ ын анық тау

Лекция мә тіні:

ДНҚ тә різді РНҚ -ң да негізгі қ ұ рлымдық бірлігі нуклеотид болып табылады. РНҚ -ң ДНҚ -дан мынадай айырмашылық тары бар-

1. ДНҚ қ ұ рлымдағ ы кө мірсу дезоксирибоза ал РНҚ -да рибоза. РНҚ -ң химиялық тұ рақ тылығ ы. ДНҚ -дан тө мен РНҚ -ң судағ ы ерітінділері гидролизге ұ шырайды. Осы қ асиет РНҚ -ні зерттейтін қ иындық тар туғ ызады.

2. ДНК РНК-нің арасындағ ы екінші химиялық айырмашылық РНК-ғ а 4 азотты негіздің біреуі ө згеше болады.

Атап айтқ анда тиминнің орнында урацил болады. Тимин сияқ ты урацил тек аденинге ғ ана комплиментарлы болады.

3. ДНҚ мен РНҚ -ң арасындағ ы 3-ші айырмашылық егер де ДНҚ қ ұ рылымы жағ ынан қ ос тізбектен тұ рса РНҚ негізінен жалғ ыз тізбектен тұ рады.

4. ДНҚ эукариоттарда негізінен ядрода жә не аздағ ан мө лшерде митохондрияда пластидтерде кездеседі. Ал РНҚ ядрода оргоноидтарда жә не бос кү йінде цитоплазмада кездеседі.

2) Клетка РНК-ң тү рлерін 3-ке бө леді:

1. Ақ параттық РНК, и РНК.

2. Тасымалдаушы РНК т РНК.

3. Рибосомалық РНК и РНК.

Бұ лардың барлығ ы тікелей ДНК – ы матрицада синтезделеді ақ параттық РНК клеткадағ ы барлық РНК-ң 3-5 пайызын қ ұ райды. Кейде оны матрицалық РНК деп атайды. Ө йткені ол ДНК-ң біршама бө лігінің кө шірмесін ө зінің бойында сақ тайды. И РНК-ң ДНК тізбегінде синтезделу процесі транскрипция деп аталады. Информациялық ДНК-ң ең қ ысқ а молекуласы шамамен 300 нуклеотидтен қ ұ ралғ ан. Олардың басым кө пшілігі аз ғ ана уақ ыт ө мір сү реді. Мысалы бактерияда бірнеше минут одан соң гидролизге ұ шырап мононуклеотидке кетеді. Эукариоттарда олар бірнеше кү н ө мір сү руі мү мкін.

Рибосомалық РНК клеткадағ ы барлық РНК-ң 80% қ ұ райды. Ең бірінші ашылғ ан РНК-ң осы тү рі рибосомалық РНК-ы кейбір хромосомалық ядролық ұ йымдастырушы бө ліктерде орындалуын ерекше гендер атқ арады. рРНК цитоплазмада белоктармен байланысқ ан кү йінде рибосома қ ұ растыруғ а қ атысады. Рибосома 60% р РНК-дан тұ рады. Негізінің р РНК-да тізбектеле орналасу тә ртібі барлық организмдерде бактериядан адамғ а дейін бірдей болады. Тасымалдаушы РНК – РНК-ң бұ л тү рінен бар екендігін Френсис Крик жормалдап, ал жорамалдың дұ рыс екенін 1955 жылы Хогленд деген ғ алым дә лелдеді. Тасымалдаушы РНК-ң молекуласы ү лкен емес, ұ зындығ ы 70-80 нуклеотид тізбегінен тұ ратын 2-лік қ ұ рылымды молекула. Бұ лар и РНК-мен бірге белок синтезіне қ атысады. Олардың қ ызметі рибосомағ а амин қ ышқ ылын тасымалдау ә рбір амин қ ышқ ылының ө зіне тә н тасмалдаушы РНК-сы болады. Кейбір амин қ ышқ ылын бірнеше тү рлі тРНК тасмалдайды. Қ азіргі уақ ытта 60 астам т РНК-ң тү рлері белгілі. Тасмалдаушы РНК-ң 2-лік қ ұ рылымы беде жапырағ ына ұ қ сас болады. Бұ л байланыстармен комплементарлы бө ліктері сабақ ша тү зеді. Ал бір тізбекті бө ліктері тұ зақ қ ұ райды. РНК молекуласының 5 ұ шында ә р қ ашанда гуамин, ал 3 ұ шында ЦЦА жә не 3^І гидроксил тобы болады.

Фенилаланин т РНК-ң қ ұ рылысы.

Аминқ ышқ ылы тасмалдаушы РНК-ң 3^І ұ шында қ осылады, басқ а бө ліктердегі нуклеатиттер тізбегі ә р тү рлі болуы мү мкін. Ортанғ ы тұ зақ тың басында т РНК-ң ерекше бө лігі ра 3 негізден қ ұ ралғ ан триплет орналасады. Ә р тү рлі аминқ ышқ ылының т РНК-ң осы бө лігі бойынша ә р қ ашан айырмашылығ ы болады.

Тасымалдаушы РНК-да АЦГ негізінен басқ а ерекше минорлы негіздер деп аталатын негіздер болады. Мысалы ашытқ ының фенилаланин т РНК-да псевдоуридин жә не дегидроуридин негіздері болады, сонымен қ атар т РНК-ң кейбір негіздеріне метилрадикалы ра метилденеді ә р бір тасмалдаушы РНК ө здерінің антикадонына генетикалық код бойынша комплементарлы келетін аминқ ышқ ылын ғ ана байланыстра алады. Бұ л процесі аминқ ышқ ыл т РНК синтетаза ферменті жү ргізіледі. Бұ л фермент АТФ-ң энергиясын пайдаланып аминқ ышқ ылын РНК-мен байланысады. Нә тижеде аминоцил т РНК комплексі тү зіледі бұ л комплекстегі акцепторлық ұ шындағ ы А нуклеин пен аминқ ышқ ылының арасындағ ы байланыс энергиясы кө рші аминқ ышқ ылдарының карбоксил тобымен пептидтік байланыс тү зуге жеткілікті болады.

Молекулалық биологияда де­натурацияланғ ан ДНК-ның бастапқ ы екі жақ ты спираль қ ұ рылымын тү зе отырып ренатурациялану қ абілетін пайдаланады. Бұ л қ ұ былыс нуклеин қ ышқ ылдарының молекулалық гибридизация ә дісінің негізінде жатады.Бұ л ә діс ә р тү рлі ДНК-лардың, сондай –ақ РНК-лардың сә йкестік дә режесін анық тауғ а мү мкіндік береді. Бұ л ү шін де­натурацияланғ ан ДНК-ны (егер де екі ә р тү рлі нуклеин қ ышқ ылдарының молекулалық гибридизациясы зерттелсе, онда оның біреуінің радиоактивті таң басы болады) екі жақ ты спираль тү зілуге оптимальді жағ дайларғ а қ ояды.(ерітіндінің иондық кү ші 0, 2 шамасында; температура нативті ДНК-ның Т_{т -}нан— 10—20 ⁰С тө мен).Толық ком­плементарлы тізбек жағ дайында олар толығ ымен екі жақ ты спиральді молекулаларғ а айналады.Ал егер де қ оспада ДНК-ның ком­плементарлы жә не ком­плементарлы емес тізбектері болса онда ренатурациядан кейін екі жақ ты спиральді молекулалардың ү лесін қ андай да бір ә дістермен анық тайды.

Қ азіргі уақ ытта ДНК-ның белгілі бір типті молекулаларын нитроцеллюлозалық сү згілерге бекітіп алып басқ а типті ДНК немесе РНК-сы бар ерітінділерге батырады. Сү згілерде екі жақ ты спиральды комплекстер тү згеннен кейін оларды байланыспағ ан ДНК-лардан бө ліп алады.Бұ лай жасауды гельдегі электрофорез арқ ылы ДНК немесе РНК-ның басқ а тізбекпен комплементарлығ ын анық тау арқ ала бө луде де қ олданады.

ДНК ренатурациясы процесінің жылдамдығ ы мынадай тең деумен ө рнектеледі

С /С_о═ 1/1+kC_ot '

мұ ндағ ы С — бір тізбекті ДНК концентрациясы;

С_о — ДНК-ның жинақ кон­центрациясы;

t — время;

k — екінші ретті реакциялардың жылдамдық константасы

Бұ л тең деуден кө рініп тұ рғ андай t уақ ыт мезетіне ассоцацияланып ү лгермеген денатурацияланғ ан ДНК ү лесі С₀t функциясы болып табылады.

Сондық тан ДНК ренатурациясы мына суретте кө рсетілген координаталарда сипатталады. Ал оның маң ызды сипаттамасына C₀/t_{0, 5} жатады, бұ л кезде реассоциация 50%.-ке ө теді.

1960-шы жылдардың ортасында Д. Виноград жә не оның ә ріптестері кейбір бактериофагтар мен митохондриялардың ДНК-сы цикльді молекулалар тү рінде болатынын ашты.Кейінірек кө пшілік вирустық немесе клеткалық ДНК-лардың пішіні сақ иналы болатыны анық талды. Егер де екі жақ ты спиральді ДНК-дан тү зілген полинуклеотид тізбектері ковалентті тұ йық талғ ан болса олар екінші қ айтара кең істікте ө здігінен қ айта ашыла алмайды.

Сақ иналы тізбектері ковалентті тұ йық талғ ан ДНК молекуласының маң ызды параметрі екі біртізбекті сақ иналалардың ондағ ы ілінісу реті. Ол Lk ретінде ө рнектеледі жә не бірінші жуық тағ анда екі спиралдік сақ инада бір тізбектің екіншісін оратылу санына тең. Сонымен Lk, шамасының бү тін санды мә ндері бар.Ең бастысы, Lk — берілген ковалентті байланысқ ан сақ иналы ДНК тұ рақ ты (инвариантты) шама.

Егер де осындай ДНК релаксацияланғ ан кү йде, болса онда ешқ андай кернеусіз бір жазық тық та орналасады, онда Lk=Tт, Тт -— берілген ковалентті байланысқ ан сақ иналы ДНК-дағ ы оралым саны. Бірақ екі тізбектің ковалентті ү здіксіздігін сақ тап спиралдің айналым санын кө бейтсек, Lk –ның инвариантылығ ы салдарынан мұ ндай ө згеріс асаоралымдар есебінен компенсациялады. Аса жоғ ары спиралденген ДНК-дағ ы аса оралым саны Wr белгіленеді (; оны жиі Раизинг деп атайды, англ. writhe -оралу) жә не мына формуламен анық талады.

Wr = Lk—Tw.

Wr –оң немесе теріс мә нді болуы мү мкін. Коваленттік тұ йық талғ ан сақ иналы ДНК-лар ә рқ ашан теріс мә нді аса оралым мә нді болады