Лекция 5

Нуклеин қ ышқ ылдарының қ ышқ ылдык гидролизі жә не нуклеотид қ ұ рамын анық тау

Жоспары:

1.Нуклеин қ ышқ ылдарының қ ышқ ылдык гидролизі.

2. Нуклеин қ ышқ ылдарың сапасын анық тау ә дістері мен принциптері.

3.Нуклеин қ ышкылдарының энзимологиялык деградациясы.

4.Экзо- жә не эндонуклеазалар. Рибозимдер.

5.Нуклеотид қ ұ рамын анық тау.

6.ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегін анық тау. Максам-Гильберт ә дісі, Сенгер ә дісі.

7.ДНҚ -ның химико-ферменттік синтезі. ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегін анық таудың дидезоксинуклеотид ә дісі.

8.М 13 фаг негізінде вектор кө мегімен ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегін анық тау,

Лекция мә тіні:

Осыдан алыс емес уақ ыттарда, бар болғ аны 70-жылдардың басында биохимиктер ДНК-ны клетканың ең зертелуі қ иын компоненті деп есептеді.. Нуклеотидтардың тө тенше ұ зын, химиялық бір дауысты жү йелілігін тұ қ ым қ уалаушылық материалда тек жанама ә дістердің - немесе қ ұ рылымды анық тай, немесе генетиқ алық талдау арқ асында мү мкін болды.

Осы шақ та жағ дай аса ө згерді.

Егер де ертеректе ДНК талдауы биологиялық молекулалардың қ ұ рылым зерттеушілеріне қ иын мә селе болса, қ азіргі уақ ытта, ДНК алғ ашқ ы қ ұ рылымдары талдаудың жаң а ә дістері енгізілген кезде ерекше ең бекті талап етпейді.

Қ азіргі уақ ытта ДНК-ның жеке учаскелерін қ ырқ ып алуғ а, оларды практика жү зінде шексіз мө лшерде алуғ а, жә не нуклеотидтер кезектілігін кү ніне бірнеше жү з нуклеотид жылдамдық пен анық тауғ а болады..

Дә л осы ә дістердің кө мегімен экспериментатордың қ алауы бойынша бө ліп алынғ ан генді ө згертуге жә не оны клетка дақ ылдарының геномына немесе жануар эмбрионына болады.Бұ л жерде ө згерген ген қ ызмет ете бастайды.

Рекомбинанты ДНК технологиясы зерттеушілерге бұ рын шешуге қ иын мә селелерді шешу жолында бү кіл клеткалық биологияғ а ә сер етті.Мысалы кө птеген жаң адан ашылғ ан белоктар мен жеке домендердің қ ызметін анық талды, эукариоттарда гендердің экспрессия механизмдерінің реттелу принциптері ашылды. Гендік инженерия ә дістерінің кө мегімен клетка пролиферациясы мен дамуды реттеуге қ атысатын кө птеген белоктарды ү лкен мө лшерде алуғ а мү мкіндіктер ашылды.Осы ә дістерді пайдалану бұ рындары кө п кү ш рен қ аржы жұ мсауды талап ететін белок табиғ атты гормондар мен жасанды вакциналарды ү лкен кө лемде ө ндіруде табыстар ә келуі сө зсіз.. Т Рекомбинанты ДНК технологиясына кө птеген ә дістер: ө зінің жаң а, сонымен бірге басқ а ғ ылымдардан да, мысалы микроорганизмдер генетикасынан алынғ ан ә дістер кіреді.

Олардың ішіндегі аса маң ыздыларына мыналар жатады:

1) ДНК –ны арнайы рестрикциялаушы нуклеазалармен қ ырқ у, соның арқ асында ә ртү рлі гендерді бө ліп алу жә не олармен манипуляциялау жылдамдайды

2) ДНК –ның тазартылғ ан фрагментінде нуклеотидтерді жылдам секвенирлеу, соның арқ асында ә ртү рлі гендердің нақ ты шекараларын анық тап олар коделейтін амин қ ышқ ылдық кезектілікті анық тауғ а болады.

3) Нуклеин қ ышқ ылдарын гибридтеу, соның арқ асында РНК немесе ДНК-ның арнайы кезектілігін олардың комплементарлы кезектіліктермен байланысу қ асиетіне сү йеніп ү лкен дә лдікпен жә не сезімталдық пен анық тауғ а болады.

Рестрикциялы нуклеазалар ДНК-ны нуклеотид кезектілігінің арнайы учаскелерінде ғ ана қ ырқ уғ а қ абілетті болады.

Клеткағ а еніп, одан соң трансформациялана алатын бө тен ДНК молекулаларынан қ орғ ану ү шін, кө птеген бактериялар бө тен ДНК-ны жоя алатын рестрикциялы нуклеазалар ферменттерін жасап шығ арады.Ә рбір осындай фермент ДНК-дағ ы 4-6 нуклеотидтен тұ ратын арнайы кезектілікті таниды.Бактериялардың ө здерінің геномындағ ы осындай кезектіліктер А мен С қ алдық тарын метилдеу жолымен жасырылып қ ойылғ ан болады, ал кез келген клеткағ а енген бө тен ДНК молекулалары нуклеазамен дереу танылып оның екі тізбегі де нуклеазамен қ ырқ ылады.

Ә р тү рлі бактерия тү рлерінен кө птеген рестрикциялы нуклеазалар бө лініп алынғ ан.Қ азіргі уақ ытта ә р тү рлі фирмалар 100-ден астам осындай ферменттер ө ндіреді, олар нуклеотидтердің ә р тү рлі кезектіліктерін таниды. Жеке рестрикциялы нуклеаза ДНК екі жақ ты спиралін кез келген ұ зындық та ә р тү рлі фрагменттерге бө ліп тастайды. Ол фрагментерді рестрикциялық фрагменттер немесе рестрикт деп атайды. Ә р тү рлі ДНК фрагменттерін анализдей отырып рестрикциялық карта қ ұ растырады онда ә рбір рестрикция сайтының басқ а рестрикция учаскелеріне қ атысты орны кө рсетіледі

ДНК –ны клондау кез келген ДНК кезектілігін ү лкен мө лшерде алуғ а мү мкіндік береді

Кө птегенрестрикциялы нуклеазалар ДНК қ ос тізбегінебірнеше нуклеотид айырмасымен кесінділер жасайды, нә тижесінде фрагмент шеттерінде қ ысқ а бір тізбекті учаскелер қ алып қ ояды. Бұ л қ ысқ а бір тізбекті учаскелер басқ а қ ысқ а бір тізбекті учаскелердің негіздерімен комплементарлы жұ птар тү зуге қ абілетті, сондық тан олар жабысқ ақ ұ штар деп аталады.

Рестрикциялы нуклеазалар арқ ылы тү зілген жабысқ ақ ұ штар ДНК кез келген екі фрагменттерін егер де олар дә л сол рестрикциялы нуклеазалар арқ ылы ү зілген болса жамауғ а мү мкіндік береді. Демек кез келген ДНК фрагментін плазмида немесе бактеиофаг сияқ ты авторепликацияланатын генетикалық элемент қ ұ рамына енгізуге болады. Осындай фрагменті бар бактериалық клонды осы ДНК фрагментін ө ндіретін фабрикамен салыстыруғ а болады. Осындай жолдармен ДНК молекулаларын кө бейтуді ДНК –ны клондаудеп атайды.

ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегін анық тау

Қ осспиралді ДНК ө лшемдері бір макромолекулағ а келетін нуклеотид жұ бы (н.ж.) арқ ылы сипатталады. Клеткалық немесе вирустық ДНК ү шін олар ү лкен шамада айырмашылығ ы болады Мысалы, аса кө п зерттелген бактериалық плазмидалар кө птеген вирус жә не бактериофаг ДНК-лары бірнеше мың нуклеотид жұ бынан (н.ж.) тұ рады.Бактериялардың жыныс факторлары, митохондрилар жә не хлоропласт ДНК-сы бірнеше жү з нуклеотид жұ бынан (н.ж.) тұ рады. Бактериялардың хромосомдары —бірнеше миллион нуклеотид жұ бы (н.ж.), ашытқ ылапр хромосомдары шамамен 10⁷ нуклеотид жұ бын (н.ж.) қ ұ райды.Адам жиынтық хромосомаларының ДНК ұ зындығ ы 3-10⁹ нуклеотид жұ бын (н.ж.) қ ұ райды

ДНК-ның нуклеотид кезектілігін анық тайтын заманауи ә дістер бір ғ ана экспериментте 150—300 нуклеотид қ алдық тарынан тұ ратын фрагменттерді секвенирлеуге {ағ ылш. sequence — кезектілік) мү мкіндік береді.Сондық тан Поэтому ДНК-ның бастапқ ы моле­куласы алдын ала фрагменттеледі.Олү шін кө бінесе ДНК-ны рестриктазалармен гидролиздейді.

Бұ л фрагменттердің нуклеотид кезектілігін анық тағ ан соң бү кіл ДНК-ның бірінші реттік қ ұ рылымын анық тауғ а мү мкіндік береді.

ДНҚ -ның нуклеотидтік тізбегін анық таудың екі принципті айырмашылығ ы бар ә дістері бар.Оның біріншісін А. Максам мен У. Гилберт ұ сынғ ан.Ол полинуклеотид тізбекті арнайы химиялық ыдыратуғ а негізделген. ДНК -ны Максама —Гилберт ә дісі бойынша секвенирлегендегі операциялардың реті жалпы тү рде мына суретте кө рсетілген.

Бұ л ә дістің негізгі принциптері мынадай:

1. Радиоактивті таң ба енгізілген ДНК фрагментінің ұ шы гомогенді болуы керек.

2.Анализделетін ДНК тізбегінің ү лгісі 4 бірдей порцияғ а бө лінеді, жә не химиялық модификация жағ дайлары осы 4 порцияның ә рқ айсысында реакцияғ а бір немесе екі пурин немесе пиримидин негіздерінің біреуі ғ ана қ атысатындай етіп таң далады.; пуриндік негіздерді N7-aтом бойынша диметилсульфатпен метилдейді, пиримидинді негіздерді гидразинмен ө ң деу арқ ылы ыдыратады; химиялық реагенттермен ө ң деу екі жағ дайда да модифицирленген мономерлі звеноның тү зілуіне ә келеді, оны полинуклеотид тізбектен бө ліп алуғ а болады.

3. Химиялық модификация шектелген жағ дайларда жү ргізіледі..

4. Негіздерді бір нуклеотид қ алдығ на дейін дә лдікпен анық тауғ а болады.

5 Фрагменттердің ұ зындық тарын жоғ ары сезімтал полиакриламид гелінің жұ қ а қ абатындағ ы электрофорез ә дісі арқ ылы анық тайды. Элект­рофорез жоғ ары температурада 7 М мочевина бар буферлік жү йеде жү ргізілгендіктен фрагментердің екінші реттік қ ұ рылымы бұ зылады

Екінші ә дісті Ф. Сэнгер ә ріптестерімен жасағ ан.Оның негізінде ДНК-полимеразалық реакция жатыр.Ә дістің принципі суретте кө рсетілген

Қ азіргі уақ ытта Максам – Гилберт жә не Сэнгер ә дісі сияқ ты ә р тү рлі ә дістер бар жә не оларды толық автоматтандыруғ а сә ті тү сті. Дә л осылай, мысалы, ДНК секвенирлеу ү шін праймердің 5'- ұ шына соң ына флоуресценциялық таң баларды енгізеді, жә не де ә рбір талданатын нуклеотидтардың тө ртеуінің ә ртү рлі спектрлік мінездемелерін анық тауда флоуресценциялаушы агенттерді қ олданылады. Барлық биохимиялық операциялар роботпен ө ткізіледі.

ДНК толық нуклеотидті жү йелілігін анық тауда автоматтардың қ олдануы принципті тү рде кез келген организм геномын адамның геномын да анық тауғ а мү мкіндік береді.