Определение уровня аллерген-специфичних IgE

Иммуноферментный анализ включает использование антител, меченных ферментом. Сущность ИФА состоит в том, что при добавлении исследуемой сыворотки, содержащей IgE-антитела к аллергену, связанному с полистироловой поверхностью микропланшет, образуется комплекс аллерген-антитело IgE. Количество связавшегося IgE, т. е. антител, определяют с помощью меченных ферментом антител против IgE. Для этого в лунки планшет для анализа вносят анти-IgE-антитела, меченные пероксидазой хрена (или другим ферментом) и сіворотку больного. В результате этого антитела против IgE специфически связываются с IgE, находящимся в комплексе аллерген-антитело IgE или свободніми от антигена (аллергена). В дальнейшем добавляют реагенты (орто-фенилендиамин и перекись водорода) и выявляют активность пероксидазы по цветной реакции, интенсивность которой оценивают на спектрофотометре.

Метод ИФА выявляет только «избыток» IgE, свободных антител в сыворотке крови, но не определяет антитела, связавшиеся с мембранами клеток - базофилами и другими лейкоцитами. Поэтому отрицательный тест не гарантирует отсутствие у больного «вооруженных» IgE базофилов и развитие аллергической реакции. Положительный тест на специфические IgE указывает на аллергию.

Нефелометрический метод микропреципитации по Уанье применяют для обнаружения IgG-, IgM-антител к гаптенам (лекарствам) в сыворотке крови. Готовят двухкратные разведения аллергена и сыворотки крови больного. В одну кювету фотоэлектроколориметра (ФЭК) вносят 1, 5—1, 8 мл исследуемой сыворотки крови (исходное разведение 1: 2), в другую — контрольный раствор или сыворотку крови здорового человека. Измеряют исходную оптическую плотность на спектрофотометре (светофильтр №4, при длине волны.= 500 нм). Затем в каждую кювету добавляют по 0, 1 мл разведенного аллергена, начиная с минимальной концентрации, и перемешивают. Через 2 мин снова определяют оптическую плотность смеси в кюветах. Реакцию проводят сначала с разными разведениями аллергена, затем, когда определена его минимальная концентрация - с сывороткой (для определения ее титра). Оптимальная концентрация гаптена - это та, которая вызывает задержку снижения или даже увеличение оптической плотности смеси. Реакция обусловлена образованием иммунніх комплексов антиген+антитело в растворе. При испытании лекарств ориентировочной концентрацией является суточная доза, растворенная в 1 л дистиллированной воды.

Реакция считается положительной, если оптическая плотность смеси сыворотка + аллерген при добавлении определенных его концентраций (как при отрицательном результате) не снижается или даже увеличивается.

Непрямой метод выброса ионов калия из лейкоцитов используется для выявления антител в сыворотке крови. Лейкоциты здорового человека обрабатывают сывороткой больного с аллергией, и если в ней были антитела, то они связываются с лейкоцитами. Добавленный аллерген связывался с антителами и вызывал выброс калия в реакционную среду. Концентрацию ионов калия определяют на пламенном фотометре.

Сравнивают концентрацию ионов калия в контрольных и опытных пробах. Превышение калия в опыте меньше чем на 15% по сравнению с контролями — реакция отрицательная. Увеличение концентрации калия в опыте более чем на 20% по сравнению с контролем указывает на сенсибилизацию к лекарственному препарату, от 15 до 20% — реакция сомнительная.

Реакция повреждения нейтрофилов основывается на нарушенных лейкоцитов под воздействием аллергена. С помощью этой реакции возможно оценить гиперчувствительность немедленного типа. Наиболее целесообразно применение этой методики для выявления сенсибилизации к медикаментам. Позитивная реакция (наличие гиперчувствительности) считается тогда, когда количество лейкоцитов уменьшились на 20-30 %.