Лабораторные исследования

Исследование факторов естественной резистентности организма

Определение С-реактивного протеина Метод выявления С-реактивного белка в сыворотке крови основываются на его способности вступать в реакцию с С-полисахаридом к пневмококку. Нормальная концентрация в плазме крови составляет 0, 8 – 8, 0 мг/л (иммуноферментный метод). Повышение концентрации происходит при острых воспалительных заболеваниях, опухолях, инфаркте миокарда, внутриматочной инфекции, хронических воспалительных заболеваниях.

Определение пропердина Пропердин – белковый компонент сыворотки крови человека, имеет большое значение как один из факторов естественной резистентности. С его наличием в сыворотке крови в значительной степени связывается ее бактерицидность, антитоксинную активность, способность нейтрализовать вирусы и ряд других защитных свойств.

Определение содержания лизоцима. Лизоцим – это фермент мурамидаза, которая разрушает гликозамингликаны бактериальной стенки. Активность лизоцима определяется биологическим методом серийных растворов, турбодиметричним методом и методом диффузии в агаре.

Определение бактерицидного свойства сыворотки крови. Реакция основывается на способности сыворотки подавлять рост микроорганизмов, который зависит от уровня нормальных антител, пропердину и комплемента. Разведение сыворотки позволяет установить не только ее способность подавлять рост микробов, но и силу бактерицидного действия, которое выражается в единицах. Снижение бактерицидного свойства сыворотки крови происходит при острой лучевой болезни, СПИДе, лейкопеническом лейкозе, хронических инфекциях.

Определение уровня гетерофильных аглютининов. Гетерофильные аглютинины относятся к группе так называемых нормальных антител и являются одним из факторов защиты человека. Образуются эти антитела в результате спонтанной мутации антигенами. Количество гетерофильных аглютининов постепенно нарастает к 5 годам жизни, достигает максимума в зрелом возрасте, и снижается в пожилом. В норме у здоровых лиц они встречаются в среднем разведении сыворотки 1: 16, с колебанием титра от 1: 8 до 1: 32. количество гетерофильных аглютининов определяется с помощью реакции Пауль – Буннеля.

Определение комплемента Общую активность комплемента определяют в гемолитической системе, которая включает эритроциты барана и специфические антиеритроцитарные антитела. Образец исследуемой сыворотки сравнивают с референтной – препаратом, который представляет собой пул сывороток крови здоровых лиц с известной комплементарной активностью. Интенсивность лизиса оценивают спектрофотометричним методом через разные промежутки времени. На основе полученной кривой определяют время 50% гемолизу (Сн50). Кроме общей гемолитической активности комплемента, с помощью радиальной иммунодиффузии по Манчини определяют концентрацию отдельных компонентов комплемента (чаще С3 и С4).

Увеличение общего количества комплемента происходит при: обструктивной желтухе, тиреоидите Хашимото, острой ревматической лихорадке, узелковом полиартериите, дерматомиозите, остром инфаркте миокарда, язвенном колите, тифозной лихорадке, сахарном диабете II типа, синдроме Рейтера, подагре.

Уменьшение общего количества комплемента происходит при: СКВ с поражением почек, остром гломерулонефрите, сывороточной болезни, иммунокмплексных заболеваниях, циррозе печенки, комбинированных иммунодефицитах, септическом эндокардите с гломерулонефритом, рецидивирующих ангионевротических отеках, пароксизмальной холодовій гемоглобинурии, миастении Гравис, вирусном гепатите с поражением суставов, смешанной криоглобулинемии, лимфоме.

Определение показателей фагоцитоза:

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение приводит к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так, как при этом нарушается функция разрушения и выведения циркулирующих иммунных комплексов из организма.

Фагоцитарное число: среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом крови. Характеризует поглощающую способность нейтрофилов. В норме составляет 5 – 10 микробных частей.

Процент фагоцитоза – процент нейтрофилов, которые принимают участие в фагоцитозе. В норме составляет 65 – 95 %.

Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунных заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности и реакции на донорский трансплантат.

Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезнь Дауна, СКВ, коллагенозах, болезни иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиации; вторичных и первичных иммунодефицитах; новообразованиях; тяжелых ожогах, травмах, стрессах; кишечных и почечных синдромах потери белка; недостаточности питания; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса.

Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить степень антигенного раздражения не активированных in vitro гранулоцитов крови. Он характеризует степень активации внутриклеточных антибактериальных систем. Принцип метода основывается на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под воздействием супероксиданиона, бразующегося в НАДФ – Н – оксидазной реакции, которая инициирует процесс стимуляции фагоцита. К фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов. Показатели НСТ – теста повышаются в начальном периоде острых бактериальных инфекций, тогда как при хроническом течении инфекционного процесса они снижаются. Санация организма от возбудителей сопровождается нормализацией показателя. Резкое снижение свидетельствует о декомпенсации противоинфекционной защиты и является прогностически неблагоприятным признаком. Показатель спонтанного НСТ – теста в норме составляет до 10 %.

Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; хроническом гранулематозе; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунних заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности.

Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезни Дауна, СКВ, коллагенозах, болезнях иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиацией; вторичных и первичных иммунодефицитах, новообразованиях, тяжелых ожогах, травмах, стрессах; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса.

Индуцируемый НСТ – тест позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Тест используют для выявления резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов. При сохраненной внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах резко возрастает количество формазан-позитивних нейтрофилов после их стимуляции латексом. Снижение показателей стимулируемого НСТ – теста нейтрофилов ниже, чем на 20 %, а моноцитов ниже, чем на 30 % свидетельствуют о недостаточности фагоцитоза. Величина стимулируемого НСТ – теста в норме составляет 20 -40 %.

Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов.

Техника проведения:

1) Лейкоциты, выделенные из крови больного, отмывают от сыворотки, подсчитывают и помещают в среду, содержащую сыворотку здорового или больного (источник опсонинов) и живые бактерии (обычно Staphylococcus aureus или Escherichia coli).

2) Смесь инкубируют при 37°C, отбирая пробы через 0, 30, 60 и 120 мин после начала инкубации. Для определения числа жизнеспособных бактерий каждую пробу быстро охлаждают и делают посев.

3) Через 2 ч после начала инкубации смесь центрифугируют. Лейкоциты и фагоцитированные бактерии оседают на дно, а нефагоцитированные бактерии остаются в надосадочной жидкости. В осадке и надосадочной жидкости определяют число жизнеспособных бактерий.

Оценка результатов В норме в течение 2 ч фагоцитами поглощается и разрушается около 95% бактерий. При хронической гранулематозной болезни число разрушенных бактерий не превышает 10%, а внутри лейкоцитов обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Присутствие живых бактерий в лейкоцитах при инкубации с сывороткой здорового свидетельствует о нарушении переваривания бактерий в отсутствие снижения способности к захвату бактерий. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой больного свидетельствует о дефиците опсонинов.

Хемотаксис лейкоцитов Нарушение хемотаксиса может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса.

Метод кожного окна С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм² (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0, 5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

Исследование хемотаксиса in vitro основано на стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции можно оценить, поместив их в камеру Бойдена или чашку Петри с агарозой.

Адгезия лейкоцитов Нарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии, например CD11/CD18. Для определения молекул адгезии применяют проточную цитофлюориметрию. Отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах проявляется поздним отпадением пуповины, рецидивирующими бактериальными инфекциями, пародонтитом. Адгезию лейкоцитов можно также оценить по их способности прилипать к эндотелиальным клеткам.