Подготовка биологических объектов для биотехнологического процесса

Выделение и подбор объекта – является важным этапом биотехнологического процесса. Однако путем простого подбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции.

Селекция – это направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Основной путь селекции – это путь от слепого отбора продуцентов к сознательному конструированию их геномов.

Традиционно для повышения продуктивности штаммов микроорганизмов использовали мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. Таким способом за длительное время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий и др. В процессе отбора на каждом этапе из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Однако использование метода селекции, основанного на спонтанных мутациях, ограничено их низкой частотой, что затрудняет интенсификацию процесса. Изменения в структуре ДНК происходят редко (10^-10 на каждый ген). Несмотря на это, в очень больших популяциях (10¹⁵…..10¹⁷ клеток) даже в одной генерации появляется 10⁵…10⁷ мутантных клеток по каждому гену. Спонтанные мутации помогают микробным популяциям приспосабливаться к новым условиям существования. Примером отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме является отбор дрожжей Saccharomyces uvarum по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей. Происходит образование обратной связи между параметром, характеризующим жизнедеятельность культуры (выделением ею СО₂) и поступлением ингибирующего фактора – этанола в биореактор. При продолжительном культивировании в такой установке получают мутантные дрожжи, устойчивые к ингибирующему действию этанола в концентрациях до 10 %. Такой подход используют для повышения устойчивости биообъектов к различным факторам: кислотам, щелочам, продуктам метаболизма, ионам тяжелых металлов и др.

Селекционеры микроорганизмов, как правило, используют индуцированный мутагенез, который способствует резкому увеличению частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое, рентгеновское или γ -излучение, корпускульные излучения типа быстрых электронов, позитронов, протонов, нейтронов, а также некоторые химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК. К числу наиболее зарекомендовавших себя мутагенов относятся азотистая кислота, алкилирующие агенты, акридиновые красители, бромурацил и др. К биологическим мутагенам относятся фаги.

Впервые в истории микробиологии и генетики возможность экспериментального получения мутаций у микроорганизмов была установлена советскими учеными Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым в 1925 г. С помощью рентгеновских лучей они нашли наследственно стойкие варианты Mucor genevensis. Широкое использование УФ- и рентгеновских лучей началось после Второй мировой войны в селекции активных продуцентов антибиотиков.

Мутационные изменения затрагивают целый ряд генов и приводят как к физиологическим, так и к морфологическим изменениям мутанта, в результате которых могут меняться требования мутанта к питательной среде и к условиям культивирования.

Последовательное воздействие одного или нескольких мутагенных факторов при ступенчатом отборе позволяет постепенно увеличить продуктивность штамма. Например, путем многократного воздействия мутагенами и отбора удалось синтетическую способность продуцента пенициллина гриба Penicillium chrysogenum в течение 40 лет увеличить в 12 тыс. раз.

Недостатками метода индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора являются:

- трудоемкость;

- отсутствие сведений о характере мутаций, т.к. селекционер проводит отбор по конечному результату.

Достижения молекулярной генетики позволили ввести в практику целенаправленные методы отбора продуцентов – по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта. Любое генетическое изменение в первую очередь затрагивает деятельность ферментов клетки. Данный метод основан на регуляции ферментов по принципу обратной связи конечным продуктом биосинтетического пути (рис. 43). Повышение концентрации метаболита ингибирует активность фермента, участвующего в синтезе метаболита, или репрессирует синтез этого фермента.

Рис. 43. Негативная регуляция биосинтетического пути конечным продуктом:

A, B, C, D – продукты реакций, катализируемые ферментами Ea, Eb, Ec, Ed

Например, при наличии глюкозы и NH₄⁺ клетки многих бактерий синтезируют все необходимые для жизнедеятельности азотсодержащие соединения. Если в среду добавить какую-либо аминокислоту, то ее синтез прекращается. Такой же эффект вызывают структурные аналоги метаболита, которые не могут функционально заменить метаболит. Так аналог аминокислоты не может войти в состав белка, поэтому в присутствии аналога рост нормальных клеток подавляется в связи с голоданием по целевому продукту. В таких условиях выживают лишь мутантные клетки с нарушенной регуляцией активности и синтеза ферментов. Мутации типов:

- фермент Еа сохранил функциональную активность, но потерял чувствительность к ингибирующему действию конечного продукта или его аналога;

- синтез фермента Еа устойчив к избытку продукта или его аналога

ведет к появлению сверхпродуктов, синтезирующих целевой метаболит в аномально высоких концентрациях.

В тех случаях, когда необходимо добиться накопления промежуточного продукта биосинтетического пути используют мутанты, у которых блокирован следующий за интермедиатом этап синтеза (рис.44).

Рис.44. Блокирование промежуточной реакции биосинтетического пути с целью получения сверхпродуцента

Такой мутант ауксотрофен, т.е. растет только при добавлении в среду культивирования вещества, служащего продуктом блокированной реакции. Однако возможны компенсирующие мутации, ведущие к активации альтернативных путей синтеза недостающих соединений. Таким образом, этот путь селекции основан на переходе от прототрофных к ауксотрофным по определенному соединению штаммам.

Следует отметить, что приоритет селекции в получении «сверхсинтетиков» в настоящее время утрачен в связи с развитием основ и практическим использованием методов генной инженерии в получении продуцентов с заданными свойствами на основе рекомбинации ДНК.