Получение генов.

а) Выделение генов из ДНК: изолированную ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), катализирующие расщепление ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-7 нуклеотидных пар). Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, образуется ступенька – одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК, полученных действием одной и той же рестриктазы, то они легко вступают во взаимодействие (по принципу комплементарности):

При необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Нуклеотидная последовательность с липкими концами может быть присоединена к вектору, предварительно обработанному той же рестриктазой или превращена из линейной молекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов.

Однако данный метод выделения генов из ДНК имеет недостатки:

1) Достаточно трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену. Наряду с интересующим геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные последовательности, мешающие использованию гена. Рестриктаза может отщепить часть нуклеотидной последовательности гена, в результате ген теряет функциональную полноценность.

2) Гены эукариот имеют сложное строение: включают экзоны и интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки, соответствующие интронам, удаляются, а участки, соответствующие экзонам, соединяясь, образуют зрелую матричную РНК. Наличие интронов является препятствием для нормального функционирования трансплантированных генов.

3) При обработке ДНК рестриктазами образуется смесь фрагментов. Выделить из нее фрагменты, несущие нужный ген – сложная задача. Бактериальная клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка – от 10 до 200 тыс. генов.

б) Химико-ферментативный синтез генов. Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает химический синтез коротких (8-16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов.

Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов. Кроме того, существует возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей.

Применимость данного метода ограничена возможностями получения информации о нуклеотидной последовательности гена. Эта последовательность может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка.

Методом химико-ферментативного синтеза получены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

в) Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки м-РНК. Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК) используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы.

Достоинством данного метода является то, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.

С помощью этого метода в 1979 г. был получен ген соматотропина (гормона роста человека).