Стадия ТП-3. Выращивание культуры в посевном аппарате V 63 л

3.1. Подготовка оборудования и трубопроводов к работе.

3.1.1. Подготовка аппарата для приготовления питательной среды.

Аппарат для приготовления питательной среды (поз. Р-12) представляет собой цилиндрический аппарат, снабженный мешалкой и рубашкой. Освобожденный от предыдущей загрузки аппарат моют водой из шланга через люк, промывную воду сливают в канализацию. Подготовленный таким образом аппарат используют для приготовления питательной среды.

3.1.2. Подготовка к работе установки непрерывной стерилизации.

Установка непрерывной стерилизации (УНС), предназначена для стерилизации питательной среды и кукурузного экстракта. Установка состоит из стерилизационной колонки (поз. Т-16), выдерживателя и коллектора, соединяющего УНС с ферментером, снабжена контрольно-измерительными приборами и регулирующими приборами для автоматического поддержания заданной температуры среды в колонке и выдерживателе.

После промывки системы УНС производят проверку запорной арматуры, приборов КИПиА и системы дистанционного управления. Не реже 1 раза в 3 дня производят проверку герметичности системы УНС гидравлическим способом при избыточном давлении свежей воды в системе Р – 0, 3 МПа. Обнаруженные пропуски (течи) устраняют и производят повторную проверку герметичности системы.

Герметичную УНС стерилизуют перед каждой операцией подачей пара в колонку (поз. Т-16) и загрузочные отростки ферментеров. Сброс конденсата осуществляют через торцы коллектора и вентили сброса конденсата с загрузочных отростков ферментеров и выдерживателя. Стерилизацию УНС проводят в течение 1 ч при давлении 0, 24-0, 26 МПа. По окончании выдержки закрывают вентили в торцах коллектора, загрузочные вентили на отростках ферментеров и вентиль сброса конденсата на выдерживателе. До начала загрузки питательной среды в УНС поддерживают давление не менее 0, 1 МПа.

3.1.3. Подготовка ферментера, индивидуального фильтра к работе.

Ферментер для выращивания биомассы грибов представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат с геометрическим объемом 63 л, с рубашкой, барботером, штуцерами для подвода и отвода воздуха, подачи питательной среды, посевного материала и отбора проб (поз. ФО-22).

Освобожденный от предыдущей загрузки посевной ферментер первоначально моют водой в количестве 0, 03 м³ и эту порцию, содержащую остатки культуры (0, 01% по сухому весу) направляют в сборник культуральной жидкости (поз. Сб-29). Затем вторично промывают 0, 03 м³ воды горячим 1% раствором каустической соды (со стадии ВР-2) – 0, 05 м³ в течение 10 мин, горячей водой –0, 05 м³ в течение 40 мин, свежей водой – 0, 05 м³ в течение 10 мин; используемый раствор каустика возвращают в сборник каустика, а промывные воды направляют в канализацию.

После освобождения ферментера от культуральной жидкости и перед каждой новой операцией аппарат тщательно моют водой. Доливают воду до уровня барботера и открывают вентиль входа воздуха. Отсутствие или ослабление барботажа на некоторых участках указывают на необходимость чистки барботера. Закрывают вентиль входа воздуха в аппарат, появление при этом пузырьков воздуха свидетельствует о негерметичности вентиля.

Промывные воды сливают в канализацию.

При строгом соблюдении правил техники безопасности производят внутренний осмотр и слесарную подготовку аппарата совместно с фильтром и арматурой с заменой, при необходимости, прокладок фланцевых соединений и сальниковой набивки вентилей.

Далее производят проверку ферментера, фильтра и коммуникаций на герметичность с помощью мыльного раствора при давлении 0, 14-0, 15 МПа. Падение давления в аппарате за 30 мин выдержки не должно превышать 0, 005 МПа.

Герметичный ферментер стерилизуют текучим паром через отростки, предварительно слив воду из рубашки аппарата.

Вентиль выхода воды из рубашки аппарата должен быть открыт. Сброс конденсата осуществляется через нижний спуск аппарата.

Стерилизацию ведут при температуре (131±1)^оС и давлении 0, 2 МПа в течение 1 ч. Давление в аппарате регулируют степенью открытия вентиля выхлопа. По истечении времени стерилизации производят перевод с парового на воздушное давление равное 0, 15 МПа путем подачи стерильного воздуха. Устанавливают расход стерильного воздуха 2, 6 м³/ч, после чего стерильный ферментер (поз. ФО-22) считается готовым к приему питательной среды.

После нестерильных ферментаций пустой аппарат стерилизуют острым паром при температуре (131±1)^оС и давлении 0, 2 МПа в течение 2 часов.

3.1.4. Подготовка сборника культуральной жидкости к работе.

Сборник культуральной жидкости (поз. Сб-29) представляет собой цилиндрический аппарат, по конструкции аналогичный ферментеру (поз. ФО-22). Освобожденный от предыдущей загрузки сборник культуральной жидкости моется, готовится и стерилизуется аналогично п. 3.1.3.

3.2. Приготовление и стерилизация питательной среды

Для получения посевного материала при культивировании продуцента используют среду следующего состава.

Состав среды.

В отдельной емкости развести муку в холодной воде, добавить в горячую воду при интенсивном перемешивании. При интенсивном перемешивании нагреть до 90 ^оС, выдержать 1 час. Охладить до (31±1)^оС. Добавить пеногаситель, соли из дозатора сухих солей (поз. Д-11) и воду до 44 л.

Подготовленную таким образом питательную среду передают на стерилизацию в УНС.

Питательную среду нагревают до температуры 130-132^оС, затем подают в выдерживатель (поз. В-17) и стерилизуют в следующем режиме: температура 131-132 ^оС, время выдержки 6-8 мин, откуда стерильная питательная среда направляется в посевной ферментер (поз.ФО-22).

По окончании стерилизации питательной среды УНС промывают свежей водой (0, 01 м³) в режиме стерилизации с направлением промывных вод в ферментер.

В аппарате для приготовления кукурузного экстракта (поз. Р-13) развести кукурузный экстракт в 3 л холодной воды, перемешать и передать на стерилизацию в УНС. Кукурузный экстракт нагревают до температуры 130-132^оС, затем подают в выдерживатель (поз. В-17) и стерилизуют в следующем режиме: температура 131-132 ^оС, время выдержки 6-8 мин, откуда стерильный кукурузный экстракт направляется в посевной ферментер (поз.ФО-22).По окончании стерилизации кукурузного экстракта УНС промывают свежей водой (0, 01 м³) в режиме стерилизации с направлением промывных вод в ферментер

После завершения приема стерильной питательной среды из УНС в ферментер ее перемешивают в течение 20-30 мин (n – 85 об/мин), насыщают кислородом путем подачи стерильного воздуха в барботер ферментера в количестве 2, 6 м³/ч, охлаждают подачей воды в рубашку ферментера до температуры (31±1)^оС. Устанавливают давление в аппарате 0, 05 МПа за счет регулирования количества отходящего воздуха. Производят отбор проб для биохимического и микробиологического контроля.

3.3. Засев и выращивание культуры в инокуляторе.

Засев питательной среды производят путем подачи посевного материала (культуральной жидкости) со стадии ТП-2 в количестве 4, 4 л по стерильному трубопроводу, который предварительно стерилизуют не менее 2 ч подачей в него пара с давлением 0, 3 МПа (стерилизацию посевного трубопровода начинают за 2 ч до засева ферментера).

Передавливание посевного материала из посевного аппарата в ферментер осуществляют стерильным сжатым воздухом при давлении 0, 12-0, 15 МПа. После передавливания посевной трубопровод пропаривают в течение 1 ч с отводом конденсата в канализацию.

Процесс культивирования продуцента фермента ведут при следующих параметрах:

Для микробиологического и биохимического контроля за процессом производят стерильный отбор проб: первая – перед засевом, вторая – после засева через 0, 5 ч, далее через каждые 4 ч. В отобранных пробах определяют: рН, ферментативную активность, концентрацию биомассы, редуцирующие вещества (РВ), морфолого-физиологическое состояние культуры, наличие посторонней микрофлоры.

Культивирование штамма-продуцента проводится в асептических условиях, что обеспечивается стерилизацией ферментера, трубопроводов, подачей в простерилизованный ферментер стерильной питательной среды и чистой посевной культуры, стерильного воздуха, установкой в ферментере стерилизуемых датчиков для контроля и регулирования параметров процесса, герметизацией уплотнения вала перемешивающего устройства, технологических трубопроводов и арматуры в течение всего процесса выращивания.

Продолжительность ферментации 64-72ч. Окончание ферментации определяют по максимальной активности лакказы

В конце ферментации культуральная жидкость должна иметь следующие показатели: накопление биомассы – 10-15 г/л (по сухим веществам), активность лакказы не менее 3, 5 ое/мл·мин, морфологическое состояние культуры хорошее.

Стадия ТП-4. Выращивание культуры в рабочем ферментере V 0, 63 м³

4.1. Подготовка оборудования и трубопроводов к работе.

4.1.1. Подготовка аппарата для приготовления питательной среды.

Осуществляется аналогично 3.1.1.

4.1.2. Подготовка к работе установки непрерывной стерилизации.

Осуществляется аналогично 3.1.2.

4.1.3. Подготовка ферментера, индивидуального фильтра к работе.

Ферментер для выращивания биомассы грибов представляет собой вертикальный цилиндрический аппарат с геометрическим объемом 0, 63 м³, с рубашкой, барботером, штуцерами для подвода и отвода воздуха, подачи питательной среды, посевного материала и отбора проб (поз. ФО-26).

Освобожденный от предыдущей загрузки посевной ферментер первоначально моют водой в количестве 0, 3 м³ и эту порцию, содержащую остатки культуры (0, 01% по сухому весу), направляют в сборник культуральной жидкости (поз. Сб-29). Затем вторично промывают 0, 3 м³ воды горячим 1% раствором каустической соды (со стадии ВР-2) – 0, 5 м³ в течение 10 мин, горячей водой –0, 5 м³ в течение 40 мин, свежей водой – 0, 5 м³ в течение 10 мин; используемый раствор каустика возвращают в сборник каустика, а промывные воды направляют в канализацию.

После освобождения ферментера от культуральной жидкости и перед каждой новой операцией аппарат тщательно моют водой. Доливают воду до уровня барботера и открывают вентиль входа воздуха. Отсутствие или ослабление барботажа на некоторых участках указывают на необходимость чистки барботера. Закрывают вентиль входа воздуха в аппарат, появление при этом пузырьков воздуха свидетельствует о негерметичности вентиля.

Промывные воды сливают в канализацию.

При строгом соблюдении правил техники безопасности производят внутренний осмотр и слесарную подготовку аппарата совместно с фильтром и арматурой с заменой, при необходимости, прокладок фланцевых соединений и сальниковой набивки вентилей.

Далее производят проверку ферментера, фильтра и коммуникаций на герметичность с помощью мыльного раствора при давлении 0, 14-0, 15 МПа. Падение давления в аппарате за 30 мин выдержки не должно превышать 0, 005 МПа.

Герметичный ферментер стерилизуют текучим паром через отростки, предварительно слив воду из рубашки аппарата.

Вентиль выхода воды из рубашки аппарата должен быть открыт. Сброс конденсата осуществляется через нижний спуск аппарата.

Стерилизацию ведут при температуре (131±1)^оС и давлении 0, 2 МПа в течение 1 ч. Давление в аппарате регулируют степенью открытия вентиля выхлопа. По истечении времени стерилизации производят перевод с парового на воздушное давление равное 0, 15 МПа путем подачи стерильного воздуха. Устанавливают расход стерильного воздуха 26 м³/ч, после чего стерильный ферментер (поз. ФО-26) считается готовым к приему питательной среды.

После нестерильных ферментаций пустой аппарат стерилизуют острым паром при температуре (131±1)^оС и давлении 0, 2 МПа в течение 2 часов.

4.1.4. Подготовка сборника культуральной жидкости к работе.

Сборник культуральной жидкости (поз. Сб-29) представляет собой цилиндрический аппарат, по конструкции аналогичный ферментеру (поз. ФО-26). Освобожденный от предыдущей загрузки сборник культуральной жидкости моется, готовится и стерилизуется аналогично п. 3.1.3.

4.2. Приготовление и стерилизация питательной среды

Для получения культуральной жидкости с высокой оксидазной активностью при культивировании продуцента используют среду следующего состава.

Состав среды.

В отдельной емкости развести муку в холодной воде, добавить в горячую воду при интенсивном перемешивании. При интенсивном перемешивании нагреть до 90 ^оС, выдержать 1 час. Охладить до (31±1)^оС.

В инокулятор с заваренной мукой добавить простерилизованный кукурузный экстракт, пеногаситель, соли из дозатора сухих солей (поз. Д-11) и воду до 440 л.

Подготовленную таким образом питательную среду передают на стерилизацию в УНС.

Питательную среду нагревают до температуры 130-132^оС, затем подают в выдерживатель (поз. В-17) и стерилизуют в следующем режиме: температура 131-132 ^оС, время выдержки 6-8 мин, откуда стерильная питательная среда направляется в рабочий ферментер (поз.ФО-26).

По окончании стерилизации питательной среды УНС промывают свежей водой (0, 2 м³) в режиме стерилизации с направлением промывных вод в ферментер.

В аппарате для приготовления кукурузного экстракта (поз. Р-13) развести кукурузный экстракт в 30 л холодной воды, перемешать и передать на стерилизацию в УНС. Кукурузный экстракт нагревают до температуры 130-132^оС, затем подают в выдерживатель (поз. В-17) и стерилизуют в следующем режиме: температура 131-132 ^оС, время выдержки 6-8 мин, откуда стерильный кукурузный экстракт направляется в рабочий ферментер (поз.ФО-26).По окончании стерилизации кукурузного экстракта УНС промывают свежей водой (0, 05 м³) в режиме стерилизации с направлением промывных вод в ферментер.

После завершения приема стерильной питательной среды и кукурузного экстракта из УНС в ферментер ее перемешивают в течение 20-30 мин (n –100 об/мин), насыщают кислородом путем подачи стерильного воздуха в барботер ферментера в количестве 26 м³/ч, охлаждают подачей воды в рубашку ферментера до температуры (31±1)^оС. Устанавливают давление в аппарате 0, 05 МПа за счет регулирования количества отходящего воздуха. Производят отбор проб для биохимического и микробиологического контроля.

4.3. Засев и выращивание культуры в рабочем ферментере.

Засев питательной среды производят путем подачи посевного материала (культуральной жидкости) со стадии ТП-3 в количестве 44 л по стерильному трубопроводу, который предварительно стерилизуют не менее 2 ч подачей в него пара с давлением 0, 3 МПа (стерилизацию посевного трубопровода начинают за 2 ч до засева ферментера).

Передавливание посевного материала из посевного аппарата в ферментер осуществляют стерильным сжатым воздухом при давлении 0, 12-0, 15 МПа. После передавливания посевной трубопровод пропаривают в течение 1 ч с отводом конденсата в канализацию.

Процесс культивирования ведут при следующих параметрах:

Для микробиологического и биохимического контроля за процессом производят стерильный отбор проб: первая – перед засевом, вторая – после засева через 0, 5 ч, третья, далее через каждые 4 ч. В отобранных пробах определяют: рН, ферментативную активность, концентрацию биомассы, редуцирующие вещества (РВ), морфолого-физиологическое состояние культуры, наличие посторонней микрофлоры.

Культивирование штамма-продуцента проводится в асептических условиях, что обеспечивается стерилизацией ферментера, трубопроводов, подачей в простерилизованный ферментер стерильной питательной среды и чистой посевной культуры, стерильного воздуха, установкой в ферментере стерилизуемых датчиков для контроля и регулирования параметров процесса, герметизацией уплотнения вала перемешивающего устройства, технологических трубопроводов и арматуры в течение всего процесса выращивания.

Продолжительность ферментации 64-72 ч. Окончание ферментации определяют по максимальной активности лакказы

В конце ферментации культуральная жидкость должна иметь следующие показатели: активность лакказы не менее 3, 5 ое/мл·мин, накопление биомассы – 10-15 г/л (по сухим веществам), морфологическое состояние культуры хорошее.

Культуральная жидкость (9/10 объема) стерильным сжатым воздухом передавливается в сборник (поз. Сб-29). В процессе передачи культуральной жидкости нужно следить, чтобы давление воздуха в индивидуальном фильтре превышало давление в ферментере не менее, чем на 0, 05 МПа во избежание переброса культуральной жидкости в фильтры и воздушный коллектор.

После слива 9/10 объема культуральной жидкости ферментер начинают наполнять свежей охлажденной до (31±1)^оС питательной средой, сохраняя тот же режим культивирования. Продолжительность культивирования, начиная со второго цикла составляет 64 часа.

Количество циклов – до 5.

Культуральную жидкость из сборника (поз. Сб-29) подают на стадию ТП-5. В сборнике культуральная жидкость может находиться не более 1 ч во избежание лизиса культуры. В случае более длительного хранения необходимо охладить культуральную жидкость до 10-12^оС путем подачи охлаждающего агента в рубашку сборника. Во избежание нарушения режима асептики в сборнике поддерживается давление 0, 03-0, 05 МПа.