Физические методы иммобилизации

Физические методы заключаются в связывании фермента без участия ковалентных связей. Данные методы подразделяются на адсорбционные и механические. При адсорбционной иммобилизации фермент удерживается на поверхности носителя с помощью электростатических, гидрофобных, водородных связей, а также в силу дисперсионных взаимодействий.

Адсорбция фермента на нерастворимом носителе является одним из наиболее простых способов иммобилизации. Процесс иммобилизации фермента осуществляется путем смешивания при подходящих условиях фермента и носителя, инкубации и отделения нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988]. Данный метод является достаточно мягким и обычно слабо влияет на каталитическую активность фермента. Недостатком его является то, что фермент может непрочно связаться с носителем. Десорбцию фермента с носителя могут вызвать даже незначительные изменения экспериментальных условий, такие как pH, температура и природа растворителя, ионные силы, а также сам субстрат.

Renato S. Freire с соавторами [Renato S. Freire et al., 2000] показали возможность иммобилизации лакказы методом физической адсорбции на углеродном волокне с целью дальнейшего использования иммобилизованного фермента в качестве биосенсора для фенольных соединений.

Rekuc A. с соавторами [Rekuc A. Et al., 2008] осуществили иммобилизацию лакказы методом физической адсорбции на целлюлозосодержащем носителе Granocel.

Другим способом иммобилизации ферментов физическим методом является механический. При механическом способе иммобилизации производят включение фермента в гели, сшитые поперечными связями, заключение фермента в микрокапсулы и волокна, мембраны и т.д [Грачева, Кривова. 2000].

При иммобилизации фермента путем включения в гель его молекула включается в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Размер молекулы иммобилизованного фермента больше среднего расстояния между соседними цепями в геле, что препятствует выходу молекул из полимерной матрицы. Удерживание молекул фермента осуществляется также ионными и водородными связями, возникающими между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями [Биотехнология. Под ред. Н.С. Егорова, 1987].

Существует два основных способа для иммобилизации ферментов в геле. Первый способ заключается в том, что фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, с целью образования полимерного геля с включенными в него молекулами фермента. Для придания полимеру структуры трехмерной сетки в реакционную смесь часто добавляют бифункциональные сшивающие агенты.

Другим способом является помещение фермента в раствор уже готового полимера, который затем переводят в гелеобразное состояние. При этом методика иммобилизации фермента зависит от того, является полимерный гель сшитым или несшитым. Метод иммобилизации фермента с помощью несшитого полимерного геля основан на свойстве природных полисахаридов, таких как агар-агар, каррагинан, крахмал, образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов.

Метод иммобилизации ферментов с помощью сшитого полимерного геля основан на введении ковалентных сшивок, которые позволяют добиться повышения механической прочности полимерных матриц и более прочного удерживания включенного в них фермента. Образование сшивок между полимерными цепями достигается при обработке функциональными реагентами, способными взаимодействовать с функциональными группами полимера.

Метод иммобилизации ферментов путем включения их в гель достаточно прост. Он позволяет достигать равномерного распределения биокатализатора во всем объеме носителя. Иммобилизованные препараты на основе полимерных гелей могут быть многократно использованы за счет высокой механической, химической и тепловой стойкости носителя. Включенный в гель фермент надежно защищен от инактивации вследствие бактериального разложения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988].

Несмотря на все преимущества этого метода, он обладает существенным недостатком. Каталитическая эффективность иммобилизованного фермента снижается в связи с тем, что полимерная матрица препятствует диффузии субстрата к ферменту.

Наиболее часто в качестве носителя для включения лакказы авторами предлагается полиакриламидный гель. Это можно объяснить тем, что данный носитель не обладает ионообменными свойствами, поэтому при иммобилизации pH-профиль активности фермента не меняется [Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда, 1988]. Так Klis с соавторами [Maciej Klis et al., 2009] использовали полиакриламидный гель для иммобилизации лакказы гриба Cerrena unicolor с целью его дальнейшего нанесения на электроды и осуществления мониторинга кислорода в растворах.

Другим широко используемым носителем является поливиниловый гель. Michaela Dina Stanescu с соавторами [Michaela Dina Stanescu et al., 2008] осуществляли иммобилизацию лакказы на макропористом носителе на основе поливинилового криогеля для повышения стабильности полученного биокатализатора и его использования в различных процессах. Yinghui с соавторами [Yinghui D. et al., 2002] использовали поливиниловый гель в качестве носителя для иммобилизации лакказы гриба Panus conchatus с целью очистки токсичных сточных вод от содержащихся в них отбеливающих веществ.

Известны способы иммобилизации лакказы в желатиновых гелях, образованных на основе воды и масляных микроэмульсий, представляющих собой систему, состоящую из трех частей: изооктан, ди(2-этилгексил)-сульфосукцинат, вода [Crecchio C. et al., 1995]. Растворение желатина в воде приводит к трансформации этих микроэмульсий в вязкий гель, в котором и осуществляется иммобилизация фермента. Данный способ иммобилизации лакказы разрабатывался для очистки различных водных суспензий от ароматических соединений.

Dayaram с соавторами осуществили иммобилизацию лакказы гриба Polyporus rubidus на Na-альгинатных шариках [Dayaram P. et al., 2008] с целью осветления синтетических красителей, содержащихся в сточных водах текстильного производства. Процесс осветления сточных вод был осуществлен в биореакторе лабораторного масштаба. Для оценки эффективности процесса осветления были использованы 4 красителя: Reactive blue, Reactive orange, Ramazol black и Congo red. Результатом проведения экспериментов стало снижения интенсивности окраски сточных вод более чем на 80% в течение 5 суток при постоянных условиях инкубации. Максимальная активность фермента была отмечена на 3 сутки инкубации и составила 17, 1 U/L. По мнению авторов, данный метод очистки сточных вод от токсичных красителей прост и не требует значительных капитальных затрат.

Интересен способ иммобилизации лакказы на Cu-альгинатных шариках [Faraco V et al., 2009] для биоремедиации сточных вод текстильного производства.

Иммобилизация фермента путем микрокапсулирования заключается в использовании искусственных клеток с мембранами, подобными мембранам природных клеток. При этом фермент удерживается внутри капсулы, а молекулы субстрата и продуктов могут свободно диффундировать через синтетические мембраны. В зависимости от способа получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров.

Микрокапсулы получают двумя основными способами [Биотехнология. Под ред. Н.С. Егорова, 1987]. Первый способ предполагает диспергирование водного раствора фермента при интенсивном перемешивании в диэтиловом эфире, в состав которого входит ПАВ, выступающее в роли эмульгатора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера. Будучи нерастворимым в воде, при соприкосновении с поверхностью эмульсионных капель этот полимер образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Отделение готовых микрокапсул осуществляют центрифугированием или фильтрованием.

Другой способ получения микрокапсул основан на проведении реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой – в объеме органической фазы. Для стабилизации фермента и обеспечения необходимого внутреннего давления в микрокапсуле, водный раствор фермента, используемый для получения микрокапсул, должен содержать около 10% инертного белка. В качестве такого белка обычно используется гемоглобин.

Повышения стабильности микрокапсулированного фермента достигают также путем его обработки глутаровым альдегидом, приводящим к образованию белковых полимеров внутри микрокапсул, либо предварительной иммобилизацией фермента за счет адсорбции на носителе, включением в гель и другими способами.

Данный метод позволяет достигать высокой эффективности действия иммобилизованного фермента за счет большой площади поверхности, приходящейся на единицу его активности. Иммобилизованные в мембранных системах ферменты в большей степени сохраняют свою каталитическую активность.

В свою очередь, недостатком метода микрокапсулирования, как и метода иммобилизации ферментов путем включения в гель, является невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов за счет создания мембраной микрокапсул непреодолимого диффузионного барьера.

Метод микрокапсулирования применим только для тех ферментов, которые не инактивируются при высоких значениях pH, существующих в водных растворах диамина.

Roman-Gusetu с соавторами иммобилизовали лакказу путем микрокапсулирования с помощью метода поверхностного связывания с полиэтиленамином [Roman-Gusetu G. еt al., 2009] с целью использования биокатализатора в различных процессах.

Для осветления азокрасителей Krishna P. Katuria с соавторами осуществляли иммобилизацию лакказы гриба Pleurotus ostreatus в хитозановых мембранах [Krishna P. Katuria et al., 2009]. Для достижения максимального эффекта осветления были оптимизированы различные параметры процесса, такие как pH 6.0, концентрация фермента 1.75 U/ml, концентрация красителя 20 мг/л, температура 30 °C и время протекания процесса 120 мин.