Студопедия

Главная страница Случайная страница

Разделы сайта

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Клетки селезенки мышей (линия MEL)






Обе системы экспрессии, описанные выше, базируются на амплификации трансгенов, обеспечивающей высокий уровень внутриклеточного синтеза кодируемых ими рекомбинантных белков в отобранных клонах клеток. Тем не менее, в природе уникальные гены (т.е. присутствующие в виде одной копии на гаплоидный геном) могут экспрессироваться с очень высокой эффективностью. Примером этого являются, например иммуноглобулины, секретируемые плазматическими клетками, или глобины, синтезируемые в больших количествах клетками эритроидного ряда. Высокий уровень транскрипции глобинового локуса становится возможным не только благодаря функционированию эффективных промотора и энхансера, но и в результате присутствия так называемой доминантной регуляторной области (dominant control region – DCR), изменяющей пространственную структуру хроматина всего локуса. DCR расположена за ~50 т.п.о. перед кластером глобиновых генов и вначале была идентифицирована благодаря присутствию в ней нескольких сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе. Путем комбинирования последовательностей нуклеотидов, окружающих сайты, удалось сконструировать небольшую искусственную DCR, обладающую всеми основными свойствами исходной. Рекомбинантные гены, объединенные в векторе с такой DCR, экспрессировались с высокой эффективностью в клетках эритроидного ряда независимо от места их интеграции в геном и не требовали для этого предварительной амплификации. Таким образом, рассматриваемая система позволяет избежать отрицательного влияния эффекта положения у рекомбинантных генов, что избавляет от необходимости скрининга большого числа трансфецированных клеток для получения высокопродуктивных продуцентов рекомбинантных белков.

Для биотехнологических целей в настоящее время часто используется линия клеток MEL-E9, которая является производной линии клеток MEL-NP5, полученных из селезенки мышей NFS, зараженных дефектным по репликации вирусом, образующим фокусы селезенки (spleen focus forming virus – SSFV). Эти клетки не образуют вирусных частиц, но вызывают возникновение опухолей после инъекции сингенным мышам. Они не претерпевают спонтанной дифференцировки, однако под действием экзогенных факторов (диметилсульфоксида, гемина или гексаметиленбисацетамида) дифференцируются в клетки, содержащие гемоглобин.

На рис. II.13, в изображена схема экспрессирующего вектора, применяемого с этой линией клеток. В нем область DCR соединена с промотором, экзоном 2, интроном 2 и экзоном 3 b-глобинового гена, поскольку показано, что присутствие последовательностей нуклеотидов интрона 2 абсолютно необходимо для эффективной экспрессии генов, направляемой этим промотором. Рекомбинантный ген может быть встроен справа или слева от интрона 2. После успешной трансфекции этот экспрессирующий вектор обеспечивает независимую от эффекта положения и числа копий тканеспецифическую экспрессию рекомбинантных генов в клетках эритроидного ряда.






© 2023 :: MyLektsii.ru :: Мои Лекции
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
Копирование текстов разрешено только с указанием индексируемой ссылки на источник.