Введение рекомбинантных ДНК в клетки

После завершения лигирования векторных молекул с клонируемыми фрагментами ДНК реакционную смесь с продуктами реакции уже можно рассматривать как библиотеку генов. Полученные таким образом рекомбинантные молекулы ДНК хранятся длительное время в замороженном состоянии, и по мере необходимости из них отбирают аликвоты реакционной смеси, содержащие требуемое количество рекомбинантных молекул, и вводят в клетки микроорганизмов для клонирования и дальнейшей работы.

Процесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клетками, сопровождающийся приобретением ими новых генетических маркеров, называют генетической трансформацией. В том случае, если бактериальные клетки поглощают ДНК бактериофагов и в результате происходит образование зрелых фаговых частиц, говорят о трансфекции фаговой ДНК. Поглощение экзогенной ДНК в процессе трансформации и трансфекции может осуществляться лишь компетентными клетками. Под компетентностью понимается такое состояние бактериальных клеток, при котором они способны сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и поглощать ее, после чего экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или существовать в виде внехромосомного элемента (эписомы, плазмиды).

Для многих грамположительных бактерий компетентность является естественным свойством, которое становится максимально выраженным на определенных этапах роста культуры. В то же время у наиболее важных для генной инженерии грамотрицательных клеток E. coli естественная компетентность вообще отсутствует и клетки приобретают ее лишь в искусственных условиях. В настоящее время установлено, что при низких температурах и в присутствии двухвалентных катионов клетки E. coli и экзогенная ДНК продуктивно взаимодействуют друг с другом и экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток. Частоту трансформации и трансфекции клеток E. coli можно повысить разными способами. Среди них наиболее популярными являются тепловой шок, введение в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb⁺), хлорида гексаминкобальта(III) или выращивание бактериальных клеток на среде с повышенным содержанием ионов Mg²⁺ (10–20 мМ).

Современные методики трансформации бактериальных клеток позволяют получать до 10⁷–10⁸ трансформантов или трансфектантов на 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК. Поскольку трансформация и трансфекция проводятся при низких концентрациях экзогенной ДНК, а для появления у трансформированной бактерии устойчивости к антибиотикам или развития фаговой бляшки достаточно проникновения внутрь бактериальной клетки одной молекулы рекомбинантной ДНК, образовавшиеся колонии или бляшки трансформантов и трансфектантов содержат, как правило, только один тип рекомбинантных молекул ДНК с идентичными вставками клонируемых последовательностей нуклеотидов.

Еще более высокой эффективности трансформации (до 10⁹–10¹⁰ трансформантов на 1 мкг ДНК) достигают при использовании электропорации. В этом случае клетки вместе с плазмидной или фаговой ДНК помещают в небольшую ячейку между двумя электродами и подвергают кратковременному (10–100 мкс) воздействию электрического поля высокой напряженности. Быстрая поляризация клеточных мембран приводит к их обратимому повреждению (образованию пор), сопровождаемому повышением их проводимости и проницаемости для макромолекул. В это время происходит эффективный перенос экзогенных молекул ДНК внутрь клеток, подвергнутых электрическому шоку. После того как рекомбинантные молекулы ДНК введены в бактериальные клетки и получены бактериальные колонии или фаговые бляшки, каждая из которых содержит рекомбинантные ДНК только одного типа, возникает важная задача отбора тех колоний или бляшек, которые заключают в себе искомые последовательности нуклеотидов рекомбинантных ДНК.