Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на агарі АГВ

Вода дистильована – 90 куб. см, АГВ – 2, 7 г, цистин (в 5 % розчині NaHCO) – 2 куб. см

Наважку АГВ внести до дистильованої води, кип'ятити до повного розчинення. Розчинити 0, 5 г NaHCO в 10 куб. см дистильованої води, внести 0, 1 г цистину і кип'ятити до повного розчинення цистину. 2 куб. см киплячого лужного розчину цистину внести до розплавленого АГВ. Довести pH до 7, 7. Розлити по 17 куб. см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 ±1 °C. Додати асептично 3 куб. см сироватки. Розлити у чашки по 20 куб. см.

Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на основі середовища Пізу. Сухий поживний агар 2 % (наважка за прописом на етикетці), м'ясо-пептонний бульйон – 100 куб. см, цистин (розчин в 1N HCl) – 1 куб. см.

Встановити pH 7, 7-7, 8 10 % розчином NaOH. Розлити по 17 куб. см в пробірки. Стерилізувати 10 хвилин при 112 ±1 °C. Охолодити до 50 °C. Додати стерильно 3 куб. см сироватки. Розлити у чашки по 20 куб. см.

Виготовлення цистину. 1 г цистину розчинити в 20 куб. см 1N HCl (порошок додавати поступово розчиняючи). 1N HCl готують з фіксаналу або 10 куб. см HCl + 90 куб. см води.

Середовище для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae на мартенівському агарі. Мартенівський пептон – 0, 5 куб. дм, м'ясна вода – 0, 5 куб. дм, агар-агар 15-18 г (1, 5 %-1, 8 %), (1, 5 % агар використовують при додаванні 20 % кінської сироватки, 1, 8 % – при додаванні 30 % сироватки ВРХ), оцтовокислий натрій – 5 г, мальтоза – 3 г.

Агар-агар промивають протягом робочого дня у проточній водопровідній воді, ретельно відтискають і переносять в 1 куб. дм мартенівського бульйону (0, 5 куб. дм мартенівського пептону і 0, 5 куб. дм м'ясної води). Встановлюють pH 7, 8-8, 0 по папірцю з індикатором крезоловий червоний, який при цій реакції змінює жовтий колір на рожево-малиновий, шляхом додавання лугу (20 % розчину NaOH) до бульйону. Бульйон кип'ятять протягом 10 хвилин, з моменту закипання, потім додають 0, 5 % (5 г на 1 куб. дм) оцтовокислого натрію, 0, 3 % мальтози (3 г на 1 куб. дм), перевіряють pH і, якщо потрібно, знову доводять до 7, 8-8, 0, кип'ятять протягом 15 хвилин, дають відстоятися в термостаті 2-3 години і фільтрують через тканинний або ватно-марлевий фільтр. Розливають в стерильний посуд і стерилізують одноразово текучою парою протягом 30 хвилин.

Поживну основу розплавляють на водяній бані при 90 °С, охолоджують до 50 °C і додають 20 % кінської сироватки (1, 5 % агар) або 30 % сироватки ВРХ (1, 8 % агар). Так, до агару, розлитого в пробірки, додають 2 куб. см кінської сироватки або 3 куб. см сироватки ВРХ, обпалюють краї пробірки і виливають (асептично) в стерильну чашку Петрі, рівномірно розподіляючи по дну чашки обережним похитуванням, не спінюючи середовища.

Мартенівський пептон. Свинячі шлунки, бажано свіжі, з пружними стінками, великою кількістю слизу і без катаральних явищ очищають від жиру (шлунки, просочені жовчю, відкидають), не промиваючи, подрібнюють у м'ясорубці. Фарш складають в бутлі місткістю 3-5 куб. дм і заливають підігрітою (40-50 °C) водопровідною водою з розрахунку 1 куб. дм води на 300-500 г фаршу. Температура повинна бути 40 °C. Додають 1 % хімічно чистої соляної кислоти (питома вага 1, 19). Масу добре перемішують і ставлять в термостат на 15-18 годин (або більше) при 37-40 °C, або при 42-45 °C на 18 годин (або більше). Під час процесу переварювання бутель струшують, спочатку через 1-1, 5 годин, потім рідше. В добре перевареному пептоні на дні бутля лежить невеликий шар дрібного темного осаду.

Повноту осадження баластних білків перевіряють шляхом додавання до 5 куб. см про­фільтрованого пептону 1-2 крапель 10 % NaOH. При цьому не повинна з'являтися каламуть.

Надосадову рідину обережно зливають, прогрівають при 80 °C протягом 10 хвилин для зупинення дії ферментів. Стерилізують текучою парою 30 хвилин, зберігають в сухому прохолодному місці. Використовують не раніше ніж через 5 діб після приготування.

М'ясна вода подвійної концентрації. Знежирене, звільнене від сухожиль м'ясо середньої вгодованості пропускають через м'ясорубку, заливають гарячою водою в пропорції 1 куб. дм води на 1 кг фаршу і залишають на ніч в холодильнику при 6 ±2 °C, вранці суміш кип'ятять протягом 15-20 хвилин з моменту закипання. Готовий настій фільтрують, фарш віджимають, одержану м'ясну воду розливають в стерильні бутлі по 250-500 куб. см і стерилізують при 121 ±1 °C протягом 20 хвилин.

Паперові смужки з індикатором крезоловий червоний. 0, 1 г крезолового червоного розчиняють в 100 куб. см 96 °C етанолу, залишають при 37 ±1 °C на 24 години, часто струшуючи. Наступного дня змочують в цьому розчині смужки фільтрувального паперу і швидко висушують. Яскраво-жовтий колір папірців у лужному середовищі переходить в різні відтінки червоного.

7.4. Середовища для визначення біохімічних властивостей

Середовище Пізу для визначення ферменту цистинази на мартенівському агарі. До 90 куб. см розплавленого 1, 5 % мартенівського агару (агар Хоттінгера не допускається!), pH – 7, 6, додають 2 куб. см 1 % розчину цистину, виготовленого на 0, 1 N розчині H SO (або HCl), ретельно перемішують і додають такий же об'єм 0, 1 N розчину NaOH для нейтралізації відповідної кількості кислоти. Розчини кислот і лугів повинні бути взаємно відтитровані, можна використовувати стандартні фіксанали. Розливають у флакони. Стерилізують при температурі 112 ±1 °C 30 хвилин.

Агар з цистином розплавляють при 90 °С (не кип'ятіть!) для збереження цистину. До охолодженого до 40-45 °C середовища асептично додають 1 куб. см 10 % розчину оцтовокислого свинцю і 9 куб. см сироватки. Розливають в аглютинаційні пробірки стовпчиком висотою 3, краще 4 см.

Пам'ятати! При 50 °C сироватка в присутності оцтовокислого свинцю згортається і середовище набуває молочного кольору, що ускладнює облік реакції.

Середовище Пізу для визначення ферменту цистинази (модифікація Ю.М. Фельдмана)

В 90 куб. см дистильованої води розчинити 3 г сухого поживного агару (краще агару " Д" або еритритагару) і прокип'ятити. Наважка сухого поживного агару розраховується, виходячи з пропису на етикетці, щоб його густина складала 1, 5 %. Додати 2 куб. см 1, 5 % розчину цистину в 0, 1 N розчині HCl з наступним підведенням pH середовища до 7, 6 2 куб. см 0, 1 N розчину NaOH (як вказано вище). Мутні або забарвлені серії агару не використовують. Середовище стерилізують 10-15 хвилин при 112 ±1 °C.

До розплавленого і охолодженого до 40-45 °C середовища додають 1 куб. см 10 % розчину оцтовокислого свинцю, 2 куб. см стерильного 10 % розчину гіпосульфіту натрію, 10 куб. см сироватки. Розливають, як в попередньому рецепті.

Пам'ятати! Розчини 10 % оцтовокислого свинцю і 10 % гіпосульфіту натрію готують ex tempore, використовуючи стерильні пробірки і дистильовану воду, стерилізують текучою парою або на водяній бані при 80-90 °C 30 хвилин.