Лекція 13. Періодичне культивування БА і його кінетичні характеристики

У відповідністю з ДСТУ – періодичне культивування (ПК) – “Спосіб одноразового вирощування мікроорганізмів посівом без видалення культуральної рідини (КР) і додавання нового поживного середовища (ПС)”.

При внесенні БА в поживне середовище (у кількості Х₀) вони ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь необхідного компоненту не стане мінімальним або не вичерпається, після чого ріст припиняється. Якщо впродовж всього цього часу в середовище не вносити ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболізму, то одержимо так звану періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі).

Особливістю ПК є циклічна зміна двох базових стадій – передферментаційних процесів та процесу біосинтезу.

Під час періодичного культивування популяція БА проходить всі стадії онтогенезу. Тривалість ПК обумовлена специфікою онтогенезу і в класичному відтворенні ПК реалізується для асинхронних культур. До асинхронних культур відносять популяції, в яких кожна клітина функціонує за законами власного онтогенезу.

Для створення математичної моделі періодичного процесу культивування доцільно провести аналіз графічної інтерпретації процесу біосинтезу, що представлений таким графіком (Рис. 4.1.). Розглянемо біотехнологічні особливості ПК на підставі аналізу логістичної кривої росту.

Потрібно відмітити, що існує декілька назв цієї графічної залежності:

- логістична крива, так як у ній більше логіки ніж реально представлених результатів досліджень;

- S – подібна крива по характеру залежності

Для розробки моделі періодичного процесу культивування потрібно визначити ряд граничних умов (допущень).

1. Біосинтез здійснюється у обмеженому просторі біологічного реактора, який імітує замкнену систему із сталим об’ємом.

2. Для біосинтезу використовується реактор ідеального змішування, що проявляється у тому, що гідродинамічні та масообміні характеристики по всьому об’єму однакові. При цьому вирівнювання градієнтів концентрацій здійснюється за 2-8 секунд.

3. Концентрація клітин постійно змінюється і ніколи не наступає явище динамічної рівноваги.

4. Як правило всі поживні речовини задаються у ПС с самого початку біосинтезу і їх кількість розрахована на отримання максимальної кількості цільового продукту (метаболіту, біомаси). Виключення представляє тип біосинтезу з внесенням підживлення.

5. Наступний цикл біосинтезу наступає після циклічного повторення предферментаційних процесів і процесів біосинтезу.

Біосинтез починається з внесення визначеної кількості посівного матеріалу Х₀ (Потрібно звернути увагу на те, що Х₀ це концентрація БА після внесення у ПС посівного матеріалу) і закінчується при використанні субстрату або при накопиченні такої кількості метаболітів, що інгибує подальший розвиток популяції.

Крива, що описує залежність логарифму кількості живих клітин від тривалості культивування, називається кривою росту.

1. Латентна фаза розвитку популяції. Лаг-фаза. Починається з моменту посіву бактерій у свіже поживне середовище. Під час цієї фази відбувається адаптація культури до нових умов культивування наприклад – перехід від твердого до рідкого ПС, зміна лімітуючого субстрату, перехід від легкозасвоюваний субстратів до більш дешевих. Супроводжується внесенням фіксованої кількості ПМ, тривалість фази залежить від рівня аеробності. Для анаеробних процесів середня тривалість 3–6год, для аеробних – 1, 5–3 год. Збільшення концентрації Х₀ на порядок призводить до скорочення фази в 1, 5-2 рази.

Х, як правило визначає масову концентрацію, кг/м³:

N – кількісну КУО/мл.

Фаза початку ростових процесів (ця фаза може не виділятися і входити у склад експоненційної фази). Характерною рисою є те, що клітини під дією тургорного тиску та транспортних процесів починають накопичувати (збільшувати) масу та об’єм, але процеси розмноження ще інгибовані.

При цьому dX/dτ > 0, dN/dτ =0.

Простежується зміна об’єму клітин.

V=V₀*e^{ζ τ} ,

де ζ - питома швидкість зміни об’ємної маси.

2. Експоненційна фаза. фаза експоненційного росту, log – фаза. Інколи її називають фазою квазістаціонарного росту, так як у цій фазі спостерігається стабілізація фізіологічних параметрів процесу.

Ця фаза характеризується максимальною швидкістю поділу клітин. У цій фазі процеси росту проходять збалансовано (тобто подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із ”стандартних” клітин. Але треба мати на увазі, що і в експоненційній фазі клітини періодичної культури зазнають змін, оскільки постійно змінюється середовище: зменшується концентрація субстрату, збільшується густина клітинної суспензії, накопичуються продукти обміну. У зв’язку з тим що в цій фазі швидкість поділу відносно постійна, вона найзручніша для визначення швидкості поділу та швидкості росту. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорганізмів визначають, спостерігаючи за показником біомаси чи кількістю клітин саме під час експоненційного росту.

Це самий важливий етап у розвитку популяції, під час якого в максимальній мірі проявляються потенційні властивості культури. Швидкість використання субстрату, виділення метаболітів та взаємовплив клітин тут проявляється в максимальній мірі, але не на стільки, щоб зменшити швидкість росту.

dX/dτ =max

dN/dτ =max

Результати кінетики ростових процесів дозволяють розрахувати μ, використовуючи напівлогарифмічні координати, в яких графік має лінійну залежність.

μ =2.3 × (lgx₂- lgx₁) /τ ₂- τ ₁

Ця фаза дозволяє розрахувати значення μ та х_макс:

х_макс=х₀ × e ^{μ τ}

3. Фаза уповільнення росту. Настання цієї фази зумовлене якісними змінами поживного середовища (споживання поживних речовин, накопичення продуктів метаболізму, дефіцит кисню, зміна рН). Клітина реагує на це зміною інтенсивності синтезу РНК, білка, полісахаридів та інших компонентів.

Під час цієї фази лімітування обумовлене одним або сумою базових факторів:

- вичерпання лімітуючого субстрату,

- вплив продуктів метаболізму,

- взаємовплив між клітинами.

4. Фаза стаціонарного росту. Вона настає тоді, коли кількість клітин перестає збільшуватись, тобто характеризується рівновагою між клітинами, що утворюються, та клітинами, що гинуть. У стаціонарній фазі спостерігається максимальна біомаса і максимальна сумарна кількість клітин. Кількість біомаси в стаціонарній фазі називають також виходом або врожаєм. Але в науковій літературі термін “вихід біомаси” або “врожай біомаси” зустрічаються рідко.

dX/dτ =0, dN/dτ =0.

В основному використовуються поняття “рівень біомаси”, “концентрація біомаси” чи просто “біомаса”.

5. Фаза відмирання. Характеризується зниженням кількості живих клітин, підвищенням гетерогенності популяції. Іноді клітини лізуються під дією своїх власних ферментів (автоліз). Ростові процеси дорівнюють процесам елімінації (розчинення).

6. Фаза уповільнення росту. Фаза виживання Характеризується наявністю окремих життєздатних клітин в умовах загибелі більшості клітин популяції. Якщо такі клітини пересіяти в свіже поживне середовище, вони починають активно рости та ділитися. Такі виживані клітини характеризуються низькою інтенсивністю процесів метаболізму. Процеси елімінації переважають над ростовими.