Методы исследования клеток и тканей

1. Прижизненное исследование клеток и тканей – in vivo

Изучаемые клетки помещают в прозрачные камеры, которые затем вживляют в организм животного. В качестве прозрачной камеры можно использовать глаз животного – объект помещают в жидкость передней камеры глаза и наблюдают через прозрачную роговицу – например трансплантация яйцеклетки и наблюдение за развитием зародыша.

2. Исследование живых структур в культуре клеток и тканей – in vitro – vitrum – стекло – в сосудах на специальных средах. Различают суспензионные культуры (клетки взвешены в среде) и монослойные культуры (клетки располагаются сплошным слоем).

Необходимо поддержание оптимальной температуры, создание питательной среды (плазма крови, эмбриональный экстракт, стимуляторы роста), стерильные условия.

Можно проводить опыты по пересадке ядер, слиянию разных тканей, исследовать действие токсинов, наблюдать злокачественное перерождение. Этически приемлемый способ опытов над человеческими тканями.

Культуры могут существовать месяцы и годы созданы чистые линии эпителиоцитов, фибробластов, макрофагов, мышечных и нервных клеток.

Разработан метод выращивания в культуре здоровых участков эпителия для трансплантации.

Получены гибридные клетки для синтеза инсулина, интерферона и др.

3. Окрашивание:

Витальное окрашивание – прижизненное – красители – трипановый синий, литиевый кармин. Применяется при окрашивании клеток крови (макрофагов).

Суправитальное окрашивание – окрашивание выделенных из организма клеток – красители – янус зеленый (для выявления митохондрий), бриллиантовый крезиловый голубой (для выявления ретикулоцитов).

4. Изготовление гистологических препаратов для изучения под световым микроскопом.

Препараты для исследования под световым микроскопом обычно представляют собой мазок (крови, костного мозга), отпечаток (слизистой оболочки), пленку (брюшина, плевра, мозговая оболочка), срез (тканей и органов – используется наиболее часто).

Изготовление срезов для световой микроскопии:

- взятие материала;

- фиксация – денатурация белков и ферментов для предотвращения процессов распада. Фиксаторы – спирт, формалин, осмиевая кислота;

- обезвоживание и уплотнение – проводят в ряду спиртов, т.к вода не смешивается с парафином;

- просветление – в ксилоле, который смешивается со спиртом и парафином;

- заливка в парафин;

- изготовление ультратонких срезов на микротоме;

- окрашивание – удаление парафина ксилолом, ксилола спиртом (ряд спиртов), вода, окрашивание. Наиболее часто используются красители гематоксилин и эозин. Гематоксилин окрашивает базофильные компоненты в синий и фиолетовый цвета. Чаще окрашивают ядро, что обусловлено наличием в нем нуклеиновых кислот. Эозин окрашивает структурные белки от розового до красного цвета – интенсивность окраски зависит от кислотности среды (лучше в кислой среде).

- обезвоживание, просветление и заливка в бальзам.

5. Изготовление гистологических препаратов для изучения под электронным микроскопом.

Для исследования под электронным микроскопом применяется:

- изготовление ультратонких срезов с тканей, предварительно залитых в смолу или пластмассу;

- оттенение металлом – напыление металла на объект с последующим удалением объекта;

- метод замораживания-скалывания – клетки быстро замораживают до – 196 ⁰С (жидкий азот) в присутствии антифриза. Замороженная клетка раскалывается а поверхность скола напыляется платиной. Органический материал удаляется.

6. Исследование химического состава и метаболизма:

- цито-гистохимические методы – для выявления ДНК, РНК, жиров, белков, углеводов и т.д. с помощью химических реакций.

- авторадиографические – с использованием радиоактивных изотопов (Н₃) для изучения метаболизма.

- иммуно-гистохимические – основаны на реакции антиген-антитело.

Артефакты – при изготовлении гистологических препаратов случайно или вследствие плохой обработки могут наблюдаться не характерные для исследуемых объектов структурные особенности – разрывы, выпадение осадка, складки, морщины и т.д. (" трехслойность" мембранных структур при прямом угле среза).