Лекция 3. 1.4. Обобщённая схема алгоритма эмпирического конструирования нового ЛВ.

1.4. Обобщённая схема алгоритма эмпирического конструирования нового ЛВ.

Основные стадии подобного пути создания ЛВ от идеи (постановки задачи) до аптеки и пациента изображены ниже на блок-схеме (рис.2).

На первой стадии проводится выбор базовой потенциально активной структуры, т.е. создается замысел (блок 1 на схеме), что синтезировать, зачем и как. Поскольку уровень общей стоимости работ зависит от многих факторов, но прежде всего определяется правильностью выбора первоначальной идеи – замысла, то остановимся на этой стадии более детально.

В этом контексте химику- синтетику, работающему в рамках стратегии «биоактивность-структура», важно знать: 1.1) для лечения какого наиболее опасного в настоящее время заболевания врачи ищут лекарство; 1.2) актуальность этого «внешнего заказа», например, в случае некой заразной болезни (переносимой от человека к человеку) должна быть обоснована эпидемиологом, который выявляет носителя заболевания – патогенной бактерии, гриба или вируса; 1.3) какие белки-ферменты или белки-рецепторы этого патогена следует дезактивировать, чтобы остановить размножение болезнетворных микроорганизмов или даже их полностью ликвидировать (это этап работы биохимика); 1.4) данные, полученные энзимологом, которые определяют наличие: 1.4.1) активного центра фермента (Fac) или рецептора (Rac); 1.4.2) природу и строение их молекулярных субстратов-лигандов (s-L); и, наконец, 1.4.3) требования к структуре потенциальных природных и синтетических ингибиторов-лигандов (i-L) целевого белка (F или R).

Естественно, что данные по пункту 1.4, для надёжного получения которых требуются главным образом рентгеноструктурный анализ F, R и s-L, стали накапливаться только с конца 20-го века. В прошлом веке их было недостаточно для проведения на их основе молекулярного компьютерного дизайна потенциального ЛВ, поэтому существовал эмпирический дизайн по методу «проб и ошибок». Этот более или менее случайный подход в открытии новых ЛВ (особенно в 1940-1950-х годах) затем стал постепенно вытесняться более целевым и фокусированным подходом с элементами рационального дизайна, оставаясь всё ещё в строю в деле создания новых ЛВ. Уместно в этой связи напомнить, что по современным представлениям (Ж.-М. Лен) под термином молекулярный дизайн понимают молекулярное конструирование синтетических лигандов (i-L) и активных центров рецепторной биомолекулы (Rac) путём правильного (на основе данных РСА) компьютерного манипулирования их геометрическими и энергетическими параметрами с целью добиться высокой степени комплементарности между рецептором и лигандом, приводящей к высокой биоактивности последнего..

Обладая этими знаниями и знаниями научной литературы по органическому синтезу, химик-синтетик выбирает соответствующую структуру потенциального препарата и производит анализ информации о наличии разнородных элементов, групп атомов, функциональных группировок, о типах связей между ними, электронном строении, пространственном расположении групп атомов. Совокупность этих данных должна сообщить целевому веществу потенциал ожидаемых свойств, включая биологическую активность. Таким образом, в разработке подобных целевых структур в начале так или иначе участвуют специалисты по медицине, биологии и биохимии. Затем к формированию замысла приступают специалисты органической, фармацевтической, медицинской и биоорганической химии, а также химии природных и биологически активных соединений.

Они же осуществляют и вторую стадию (блок 2 схемы), которая заключается в лабораторной разработке путей и методов синтеза целевого вещества и его близких структурных аналогов, их отборе по устойчивости, простоте получения, выходу, растворимости и технико-экономическим показателям. В данном конкретном примере приступает к работе химик-синтетик, который синтезирует вещества потенциальных ингибиторов, делая уже на этой стадии предварительную оценку доступности, стоимости и токсичности исходных реагентов. Синтезированные соединения затем передаются биологам на биоскрининг в эксперименте.

Биотестирование на третьей ступени (блок 3) схемы - главное сито, на котором отбраковывается основная масса неактивных и малоактивных синтезированных соединений, и остаются для продолжения углубленных испытаний наиболее перспективные вещества, обладающие высокой биологической активностью. Первый этап поиска нового ЛВ называют первичным биологическим скринингом (просеиванием). Его проводят в биологических лабораториях в стандартных условиях на отдельных белках-ферментах и живых клетках, микроорганизмах или на кусочках живых тканей (in vitro).

3.1. Биохимические тесты проводят в пробирках, в выемках плат и чашках Петри, которые содержат тестируемый фермент, к которому добавляют синтезированное вещество. Чаще всего это тест на ингибирование белковой молекулы. Выбирают активные вещества в режиме «да/нет» и создают набор («библиотеку») соединений, выделившихся своей активностью («да»), у которых константа или концентрация (концентрация потенциального ЛВ, при которой активность биомишени снижается на 50%) ингибирования достаточно высоки. Их определяют часто колориметрически.

3.2. Клеточные тесты осуществляют на культурах живых клеток. Это тестирование более сложное, т.к. ЛВ может не только взаимодействовать с рецептором на поверхности клеточной липофильной мембраны но и может проникать через неё внутрь клетки и взаимодействовать там с внутриклеточной мишенью. Активность ЛВ в данном случае может означать, что оно может оказывать лечебное действие через кровь, но остаётся вопрос о его биодоступности при приёме через РТ или о его прохождении через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

После первичных скринингов исходной библиотеки веществ (скажем, 10000 веществ)

выбираются проявившие желаемую биоактивность вещества - «хиты». Их может остаться всего одна тысяча (ниже в виде опрокинутой пирамиды условно представлена напряжённость отбора веществ).

Исходная библиотека ---------------------------------------- 10000 веществ

Хиты ------------------------------- 1000 веществ

Лидеры ----------------------- 100 веществ

Кандидаты -------------- 10 веществ

ЛВ -- 1-2 вещества

Из них затем формируют группу «лидеров» - биологически активных веществ, служащих исходными для их эволюционной химической модификации-оптимизации с целью конструирования структур-кандидатов в ЛВ с повышенной и селективной биоактивностью, нетоксичных и высоко (главным образом орально) биодоступных.

Для причисления вещества к лидерным оно должно отвечать ряду критериев. Лидеры как потенциальные ЛВ (ПЛВ) должны

1) проявлять желаемую и возможно высокую биоактивность (основной критерий отбора);

2) обладать биоактивностью в микро- и особенно в наномолярных концентрациях;

3) иметь хорошие фармакокинетические характеристики. Стремятся, чтобы лидерная молекула была орально доступна (чаще всего в виде таблеток), для чего она не должна быть слишком полярна, что мешает её хорошей адсорбции в ЖКТ. Она не должна быть слишком липофильна, иначе она быстро транспортируется в печень. В целом лидерная структура должна быть сбалансирована по липофильности/гидрофильности и должна быстро преодолевать иммунный (защитный) барьер из ферментов цитохромов (CYP – P450). Эта система защищает организм от большинства ЛВ-ксенобиотиков, быстро их метаболизируя окислением до водорастворимых производных, которые легче выводятся из организма;

4) ПЛВ должны иметь низкую острую токсичность (ЛД₅₀ , смертельная доза для 50% опытных животных, выражаемая в мг лекарственного вещества на кг живого веса). Выясняется также субхроническая токсичность ПЛВ в условиях длительного (несколько месяцев) введения лекарственного вещества в терапевтических дозах (которые обычно в 20 и более раз должны быть ниже LD₅₀). При этом наблюдают возможные побочные эффекты и патологические изменения всех систем организма: тератогенность, влияние на репродуктивность способность воспроизводить потомство) и иммунную систему, эмбриотоксичность (отравление плода), мутагенность (изменение наследственных функций), канцерогенность, аллергенность и другие вредные побочные действия. ПЛВ не должно содержать токсофорные группы атомов и не давать токсичные метаболиты. Тем не менее, иногда в медицине пользуются токсичностью, например, при лечении алкоголизма. Так, дисульфирам (тетраэтилтиурамдисульфид, антабус, тетурам) обладает необычной дитиокарбаматной (токсофорной?) группой, которая при попадании этого вещества в кровь больного блокирует метаболическое окисление этанола в альдегид:

[Et₂N-C(S)-S-]₂ антабус (тетурам)

В результате употребление пациентом даже малейших доз алкоголя приводит его в чрезвычайно болезненное состочние;

5) ПЛВ должны иметь хорошие фармакодинамические характеристики, т.е. требуемую селективность и прочность связывания с биомишенью; структура лидера должна соответствовать активному центру целевого белка (Rac), чтобы как «ключ-в-замок» входить в него и неконкурентно (предпочтительно обратимо) блокировать доступ к нему нативного субстрата (принцин ингибирования). Подобные свойства сообщаются лидерной молекуле методами химической модификации (оптимизации) её структуры – введением заряженных и полярных группировок, доноров и акцепторов водородных связей, пи-электронных систем для стэкингового взаимодействия, стерических групп атомов. При эмпирическом дизайне лидера обычно стремятся, чтобы ПЛВ было структурно похоже на природный субстрат данной мишени. Однако при этом оно должно содержать и заметное отличие от него из-за опасности быстрого метаболизма конструируемого ЛВП ферментом. Специфичность связывания лидера с определённой биомишенью – важная характеристика создаваемого ПЛВ. Её отсутствие указывает на риск проявления ПЛВ массы побочных эффектов (аллергий, головокружений, тошноты, рвоты, выпадения волос, потеря слуха болезненных привыканий и др.) из-за возможности взаимодействия такого ПЛВ со многими и разнообразными белками (типичный пример мощные противораковые средства группы цисплатина). С другой стороны в настоящее время развивается направление по дизайну неспецифических ПЛВ, которые могут оказывать лечебное действие разной силы сразу по двум-трём сопутствующим заболеваниям у одного пациента (мультицелевые ЛВ);

6) лидеры должны быть разделены на индивидуальные энантиомеры или диастереомеры в случае наличия хиральности у проектируемого ПЛВ. Рацематы могут содержать энантиомеры, обладающие совершенно различным биодействием, включая токсическое. В случаях хиральной зависимости биоактивности асимметричесий центр в молекулах лекарственного вещества должен ориентироваться тремя точками на хиральном участке биорецептора, чувствительном к асимметрии препарата. При их «нормальном взаимодействии», т.е. комплементарном трехточечном

контакте (W...W’, Y...Y’, Z...Z’, рис.1), проявляется полезный лечебный эффект. Второй же антипод оказывается некомплементарен активному участку рецептора (правая часть рисунка, W...W’, Y...Y’, а Z не взаимодействует с Z’) и может иметь менее выраженный (или совсем не проявить) лечебный эффект или даже

оказаться токсичным веществом. Так, установлено, что левовращающий энантиомер кокаина почти в два раза более активен в качестве местного анестетика и в четыре раза менее токсичен, чем его правовращающий оптический антипод. Очевидно, что требование двухточечного контакта лекарственного вещества с рецептором снимает различия в биодействии оптических изомеров. В настоящее время среди поставляемых на фармацевтический рынок хиральных лекарственных веществ лишь 15% производится в виде индивидуальных стереоизомеров (остальные - в виде рацематов или диастереомеров).

К необходимости резкого ужесточения требований по детальному исследованию побочных эффектов потенциальных лекарственных веществ пришли в 1960-х годах, когда обнаружилось, что использование снотворного под названием " талидомид" беременными женщинами стало приводить к рождению детей с уродливыми органами. В связи с этим талидомид попал под запрет, а его дополнительное изучение показало, что его применяли в виде рацемата, т.е. смеси двух оптически активных энантиомеров, из которых (+)-R-энантиомер обладает снотворным действием и нетоксичен, а его (-)-S-форма вызывает тератогенность (врожденные уродства):

Подобная зависимость биоактивность-хиральность особенно ярко выражена в ряду стереопроизводных циклопропана (1-4), у которых наибольшей инсектицидной активностью обладают транс -изомеры (1-4), среди них 1R-изомерные соединения на 2-3 порядка более активны, чем 1S-формы:

Любопытно, что при замене 1, 1-диметил-винильной группы на 1, 1-дигалогенвинильную (см. структуры соединений 5) наибольшую активность проявляют уже не только (1R)(+)- транс- изомеры, но и (1R)(+)- цис -изомеры. При этом цис -изомеры оказались значительно токсичнее транс -изомеров в отношении мух и тараканов.

7) лидеры должны иметь нужное соотношение водорастворимости и липофильности;

8) обладать простотой синтеза и высокой стабильностью;

9) быть новыми соединениями, что является важным в отношении патентуемости.

Испытания на животных (in vivo). Эти более дорогие тесты осуществляют на млекопитающих - мышах, крысах, кроликах, собаках, морских свинках и обезьянах. Изучаются при этом эффективность потенциального ЛВ (ПЛВ), его острая и хроническая токсичность (в целом до 6-7 лет), побочные эффекты, оральная биодоступность лидеров и их аналогов. Здесь синтезируемые модификации лидеров проверяются на их соответствие другим перечисленным выше требованиям, включая фармакокинетические и фармакодинамические характеристики и наиболее подходящие формы применения и условия хранения. При этом между фармакологом и химиком устанавливается тесная интерактивная связь, которая способствует быстрейшему проведению химической модификации и созданию наиболее эффективных аналогов-лидеров. По достижении удовлетворительных результатов, отвечающим основным требованиям, формируется группа «кандидатов» в ЛВ, которые передаются на завершающий этап экспериментального тестирования – углублённые испытания на людях.

Клинические испытания на людях. Данный этап тестирования (блок 4 схемы) - наиболее ответственная стадия. Она состоит из трёх фаз.

Фаза I заключается в проверке безопасности ПЛВ для здорового взрослого человека. Эта стадия не связана с той болезнью, которую предназначено лечить данное ПЛВ. Она продолжается 1-2 года и на ней отсев ПЛВ составляет до 30%.

Фаза II имеет цель установить на нескольких сотнях больных данной болезнью с различными стадиями заболевания: а) успешность её лечения данным ПЛВ; б) необходимые терапевтические дозы; в) наличие побочных эффектов. Изучение продолжается 2 года при отсеве ПЛВ до 70%.

Фаза III тестирования предназначена для изучения и уточнения на нескольких тысячах пациентов: а) доз и режимов приёма ЛВ; б) побочные эффекты; в) совместимость данного ПЛВ с другими ЛВ; г) этническую, сезонную, возрастную и половую зависимости уровня проявления лечебного действия ПЛВ. Совсем недавно возникла наука фармакогенетика - часть фармакологии, изучающая зависимость лечебных и токсических эффектов одного и того же лекарственного вещества не только от пола и возраста больных, но и от их генетических особенностей и, в частности, от их этнической принадлежности. Продолжается тестирование 1-2 года при 75% отсеве ПЛВ. Отсевы ПЛВ большей частью основаны на плохих параметрах их фармакокинетического поведения в организме больного - абсорбции, распределения, метаболизма, элиминирования и токсичности (принцип АРМЭТ или ADMET: Adsorption-Distribution-Metabolism-Elimination-Toxicity). Третий и четвертый исследовательские этапы-блоки наиболее длительны, и в них принимают участие фармакологи, биологи, токсикологи и медики.

В случае положительных клинических испытаний вся документация о потенциальном лекарственном веществе (ПЛВ) поступает на рассмотрение в Фармацевтический Комитет Государства, где законодательно утверждается (получает официальный статус) в качестве лекарственного вещества (ЛВ).

После этого наступает этап разработки технологии промышленного синтеза ЛВ - пятая стадия (блок 5 схемы). Она является самой дорогостоящей, трудоемкой и энергоемкой. Осуществлением этой стадии занимаются технологи, инженеры, химики, физико-химики и экономисты. С заводского производства лекарственное вещество поступает в продажу (блок 6). Эффективность рекламы полученного таким образом препарата и объемы его продажи определяют в дальнейшем срок жизни самого лекарственного вещества. Суммарные затраты на создание нового препарата колеблются в настоящее время от 0.3 до 1.0 миллиарда долларов. Стоимость работ по первым двум блокам составляет 10-15%, по третьему блоку – до 30%, по четвёртому блоку – 10%, по пятому – от 25- до 40%. Ниже представлена более подробная блок-схема разработки нового ЛВ:

Рис. 1. Общая схема разработки лекарственного вещества.

В данную схему включены стадии разработки технологии пилотного, полузаводского и, наконец, промышленного производства (шестая и седьмая стадии), а также стадия (восьмая), на которой производимая субстанция проходит государственную валидацию и сертификацию, где ей придается статус полного соответствия требованиям к лекарственному препарату и данное лекарство, таким образом, получает разрешение на широкое применение в медицине. Под термином «валидация» ЛВ подразумевается официальная оценка соответствия утвержденным нормативам всех этапов производства и контроля ЛВ (начиная от исходного сырья и полупродуктов и кончая самой лекарственной субстанцией и готовой лекарственной формой). Сертификация ЛВ и его производства – это процедура получения производителем и/или распространителем ЛВ письменного свидетельства (гарантии) от независимой третьей стороны (выдается органами, специально аккредитованными министерством здравоохранения) о том, что данное ЛВ (субстанция, препарат) по качеству и безопасности соответствует требованиям, установленным спецификацией, а используемый процесс его производства отвечает международным правилам надлежащей производственной практики (Good Manufacturing Practice – GMP). К современным лекарственным веществам предъявляют многочисленные жесткие требования и поэтому валидация и сертификация могут занять по времени от полугода до трех лет. На девятой стадии изучаются и создаются приемлемые формы применения препарата – порошки, растворы, мази, капсулы, таблетки, аппликаторы и т.п. После достижения соответствия требования международным стандартам GMP лекарственный препарат поступает в продажу (десятая стадия). Эффективность рекламы полученного таким образом препарата, потребности рынка в нем, эффективность лечения пациентов, объемы и сроки доставки и продажи определяют длительность существования данного лекарственного вещества на фармацевтическом рынке. По некоторым оценкам только три из десяти ведущих лекарственных препаратов покрывают расходы на их создание. Тем не менее, в целом химико-фармацевтическая промышленность считается в настоящее время одной из самых привлекательных по прибыльности. Действительно в США каждый доллар инвестиций в производство лекарственного вещества приносит десять долларов прибыли, что привело даже к появлению нового термина «фармакоэкономика». Отметим, что в 2007 году объем мирового фармацевтического рынка превысил 500 млрд. долларов (на Россию приходилось около 15 млрд. долларов).