Количественный учет микробов в почве

Микроорганизмы в почве распределены неравномерно. Поэтому для их учета в этой среде взятые образцы смешивают в стерильной банке. Из средней пробы 1 г почвы переносят в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды (полу­чается разведение 10^-2, его готовят заранее).Из разве­дения 10^-2 1 мл переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (получа­ется разведение 10 ^-3) и т. д. Схема приготовления разведении:

1. 1 г почвы + 99 мл стерильной воды — 10 ^-2.

2. 1 мл разведения 10 ^-2 -|- 9 мл стерильной воды— 10 ^-3

3. 1 мл разведения 10 ^-3 + 9 мл стерильной воды —10 ^-4.

4. 1 мл разведения 10 ^-4 + 9 мл стерильной воды — 10 ^-5

Из последних разведении по 1 мл вносят в стерильные чаш­ки, после чего заливают по 10—12 мл расплавленного и охлаж­денного до 45°С МПА, содержимое равномерно распределяют и оставляют на ровной поверхности. Чашки с застывшей средой переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Через 3—4 дня подсчитывают выросшие колонии, умножают на разведение и определяют количество живых микроорганизмов в 1 г сырой почвы.

Для пересчета на 1 г абсолютно сухой почвы ее высушивают до постоянной массы, устанавливают влажность и вносят поправку.

ЗАНЯТИЕ 9. Учёт результатов посева воды и воздуха. Коли-титр, коли-индекс. Санитарная оценка воды.

Цель занятия. Подсчитать колонии (в чашках Петри). Провести подсчет микробов из воздуха в разных комнатах, высеянных седиментационным методом по Коху. Ознакомиться с определе­нием коли-титра, коли-индекса и санитарной оценкой воды, а так­же с определением количества микробов в почве методом прямого счета под микроскопом.

Оборудование и материалы. Чашки Петри, в которые сделан посев воды и воздуха. Почва. Стерильная вода. Стерильная колба. Стерильные пипетки (10 мл) и микропипетки (0, 1 мл). Предметные стекла. Крышки от чашек Петри. Окулярная сетка. Горелки, спички.

Для демонстрации хорошей и плохой воды: два ряда колб и пробирок со средой Булижа и высеянной в нее водой с коли-титром в первом ряду 0, 1; во втором ряду— 100. Рост Е. coli на среде Эйкмана, РДА.

Определение коли-титра. Коли-титр — наименьшее количество воды (мл), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Наличие кишечной палочки в воде указывает на загряз­нение ее содержимым желудочно-кишечного тракта. В отличие от других микроорганизмов воды, кишечная палочка может раз­виваться при температуре 43—46⁰С, легко сбраживает углеводы с образованием кислоты и газа. Это свойство микроба положено в основу определения коли-титра. Существует несколько методов определения коли-титра.

Определение коли-титра на среде Эйкмана. Исследуемую воду высевают на среду Эйкмана (пептон 1 г, натрия хлорид 0, 5 г, глюкоза 0, 5 г, водопроводная вода 100 мл, рН 7, 4—7, 6). При необходимости готовят концентрированную среду, для этого количество веществ, кроме воды, увеличивают в 10 раз. Глюкозу можно заменить лактозой или маннитом. Водопроводную воду, в зависимости от численности людей в населенном пункте, сеют:

а) в городах до 1 млн. человек в объеме 300 мл: два объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл;

б) в городах свыше 1 млн. человек в объеме 500 мл: четыре объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл.

Чистую воду открытых водоемов сеют в количестве 100, 10 и 0, 1 мл (1 мл воды, разведенной 10 ^-1 ); загрязненную—10, 1 и по 1 мл воды, разведенной 10 ^-1, 10 ^-2, 10 ^-3 и т. д. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С и выдерживают в течение суток. Через 7—12 ч пробирки на время вынимают из термостата и делают пересев в розоловый дифференцированный агар (РДА). На РДА выращивают при 37 " С, и если имеется кишечная палочка, то через 12—17 ч среда желтеет, разрывается. Среда Эйкмана к этому времени (24 ч) мутнеет, образуется газ. При необходи­мости проводится идентификация Е. coli.

Состав РДА. МПА (рН 7, 4—7, 6) 100 мл, желчи 5 мл, лактозы 1 г, глюкозы 0, 1 г, 1%-ного спиртового раствора индикатора бромтимолового синего и 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты по 0, 2 мл. Среду разливают по 3—4 мл в пробирки и стерилизуют в течение 15—20 мин при температуре 112°С. Часть среды скашивают, так как посев делают уколом и на ско­шенную поверхность.

Посевы помещают в термостат на сутки при температуре 43°С. Рост сапрофитной микрофлоры при этой температуре подавляется. При наличии кишечной палочки она сбраживает маннит, индикатор (нейтральный красный) редуцируется, и среда принимает соломенно-желтое окрашивание, мутнеет, в «газовках» появляется воздух.

Для того чтобы убедиться, что изменения произведены ки­шечной палочкой, из пожелтевшей среды делают посев на среду Эндо. Посевы на среде Эндо помещают в термостат (37 °С) на сутки. Появление красных с металлическим блеском колоний, обнаружение при микроскопии грамотрицательных палочек и соответствующих изменений на цветном ряду подтверждают на­личие кишечной палочки.

Определение коли-индекса методом мембранных фильтров. Мембранные фильтры, употребляемые при исследовании воды, имеют различную проницаемость и разные номера. Наиболее часто применяют фильтр №3. Фабричные фильтры дважды кипятят в дистиллированной воде (в химическом стакане). Затем подготовленные бумажные фильтры накладывают матовой по­верхностью кверху на сетку асбестового фильтра Зейтца. Через фильтр пропускают определенное количество воды (до 500 мл, в зависимости от загрязнения). После фильтрации с помощью фламбированного пинцета фильтр кладут блестящей поверхностью на среду Эндо в чашки Петри. Чашки ставят в термостат при температуре 37 ° С или лучше при 43°С на сутки. На белой поверхности фильтров при наличии ки­шечной палочки появляются красные колонии, которые и подсчи­тывают. Методом мембранных фильтров определяют коли-индекс, то есть количество кишечных палочек, содержащееся в 1 л воды. Для перевода коли-титра в коли-индекс необходимо 1000 разделить на число, показывающее коли-титр. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Пример. При коли-титре, равном 10, коли-индекс равен 100. При коли-индексе, равном 5, коли-титр равен 200.

Санитарная оценка воды. Согласно ГОСТ 2874—73 на питье­вую воду, общее количество микробов (микробное число) в 1 мл при посеве не разведенной воды и выдерживании ее в течение 24 ч при 37 °С должно быть не более 100. В 1 л воды при определении методом мембранных фильтров кишечных палочек должно быть не более трех. При использовании бродильных проб титр кишеч­ной палочки должен быть не менее 300. К водопроводной воде в городах с населением свыше 1 млн. человек должны предъявляться более высокие требования.

Вода открытых водоемов считается хорошей при коли-титре 100, коли-индексе 10. При коли-титре ниже 1 вода непригодна к употреблению. Следовательно, чем выше коли-титр, тем вода чище, лучше, и наоборот, чем ниже, тем качество ее хуже.

Для демонстрации плохой и хорошей воды открытых водоемов ее высевают на среду Булижа: в первый ряд — с коли-титром 100 и выше (вода хорошая); во второй—с коли-титром 0, 1 и ниже (вода плохая). По изменению окрашивания среды (от мали­ново-красной до желтой) можно установить наличие кишечной палочки в определенном объеме исследуемой воды и ее качество.

Подсчет колоний в чашках Петри. На мясопептонном агаре в чашках Петри подсчитывают выросшие колонии из разведении 10 ^-2, 10 ^-1 и не разведенной воды. После подсчета ко­лоний получаемый результат умножают на разведение и определяют среднее число. Качество воды оценивают по содержанию микро­бов в 1 мл:

Хорошая вода до 100

Сомнительная вода от 100 до 500

Плохая вода от 500 и более

Содержание микроорганизмов в воздухе разных комнат опре­деляют путем подсчета колоний на всей поверхности питательной среды чашки. В зависимости от количества выросших колоний делают заключение о микробной загрязненности воздуха в по­мещении.

Чистым воздух считается в том случае, если в 1 м ³ летом содержится 1500, а зимой —4500 микроорганизмов; в загряз­ненном воздухе соответственно 2500 и 7000 микробов (по А. И. Шарифу).

Определение численности микробов в почве методом прямого счета. Наряду с другими методами число микробов в почве можно определить прямым подсчетом их под микроскопом. Такие методы разработаны С. Н. Виноградским (1952), Д. Г. Звягинцевым (1959) и другими исследователями. Подсчет микробов по Виноградскому проводят под обычным световым микроскопом, в то время как для выполнения подобной работы по Звягинцеву тре­буется флуоресцентный микроскоп, который может быть не в каж­дой студенческой лаборатории.

Метод прямого счета микробов под микроскопом, предложен­ный С. Н. Виноградским, имеет ряд достоинств, но он громоздок, поэтому его чаще применяют в модификации О. Г. Шульгиной. Он сводится к следующему. Из средней пробы отвешивают 5 г почвы и вносят в Эрленмейеровскую колбу объемом 250 мл. Почву заливают 50 мл стерильной воды, встряхивают в течение 5 мин, после чего в течение 1 мин отстаивают. Из колбы стерильной пипеткой берут 0, 01 мл суспензии и распределяют ее на площади 4 см² предметного стекла (под стекло кладут очерченный квадрат такой же площади). После подсушивания препарат заливают тонким слоем 0, 1%-ного водного раствора агара, вновь подсу­шивают, фиксируют 96 %-ным этиловым спиртом в течение 10—20 мин и окрашивают 1—2 мин фуксином основным феноловым Циля или другим красителем. Затем краситель сливают и смы­вают его путем погружения стекла до 5 раз в стакан с водой. Высу­шивают на воздухе. Количество клеток подсчитывают под иммер­сионным объективом микроскопа в 50—100 квадратах окулярной сетки, которую помещают на постоянную металлическую диафрагму между глазной и собирательной линзами окуляра. При объективе Х90 и окуляре XI0 сторона клетки окулярной сетки равна 0, 02 мм, а ее площадь 0, 0004 мм².

Расчет. При увеличении в 900 раз на площади в 1 см вмещается 25*10 ⁴ квадратов окулярной сетки (1 см ² = 100 мм ², 100 мм ² : 0, 0004= 25*10 ⁴), а на 4 см

Для определения микробов в 1 г почвы необходимо среднее количество клеток в одном квадрате окулярной сетки умножить еще на 1000, так как в 0, 01 мл суспензии содержится 0, 001 г почвы. При наличии в квадрате окулярной сетки трех микробных клеток в 1 г почвы их будет 3*10 ⁹, при наличии пяти—5*10 ⁹ и т. д.