Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Изучение процесса деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами биопрепарата «МД» методом газовой хроматографии

Процесс деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами осуществлялся путем ежедневного (в течение 48 суток) отбора проб из реакционной массы на химический и микробиологический анализы. Нефрас является сложной многокомпонентной системой содержащей 98 индивидуальных компонентов всех классов углеводородов. По данным анализа методом газовой хроматографии судили об остаточном содержании и степени деструкции компонентов нефтепродукта и отдельных классов углеводородов.

Согласно литературным данным [5], вследствие простого строения углеродной цепи первыми биодеструкции подвергаются молекулы алканов, изоалканов и циклопарафинов.

Из рисунка 3.1 видно, в первые сутки происходит значительное снижение количества алканов в смеси, их концентрация через 24 часа снизилась на 49%. Минимальное содержание парафинов в анализируемом нефтепродукте наблюдается после 96 часов воздействия микроорганизмов. Снижение парафинового потенциала при биохимическом окислении происходит за счет удаления из модельной системы н-алканов как веществ, преимущественно потребляемых микроорганизмами.

Рисунок 3.1 - Динамика деструкции нафтенов и парафинов

Среди н-алканов бактериями лучше усваиваются низкомолекулярные соединения, что согласуется с литературными данными [5]. Кроме того, не установлено какой-либо избирательности в биоокислении углеводородов с четным или нечетным числом атомов углерода в молекуле. Концентрация нафтеновых углеводородов спустя 72 часа биодеструкции сводится к нулю.

Циклоалканы труднее поддаются микробиологическому окислению, чем н-алканы с таким же числом углеродных атомов в цепи. Микроорганизмы способны окислять циклоалканы с раскрытием кольца, однако циклоалканы медленнее исчезают из среды, чем углеводороды с открытой цепью.

Изменение концентрации изоалканов в процессе биотрансформации (рисунок 3.2) наблюдается через 24 часа, когда доля изоалканов снизилась в 3, 7 раза по сравнению с первоначальным содержанием.

Рисунок 3.2 - Снижение концентрации изопарафинов

Деструкции изопарафинов происходит за счет биотрансформации (химическая модификация) вещества под действием ферментативного аппарата углеводородокисляющих микроорганизмов: изомеразы (катализирует структурные превращения изомеров) и дегидрогеназы (катализирует перенос протона, отщепление водорода).

Механизм действия ферментов выглядит следующим образом:

1) связывание субстрата активным центром фермента;

2) образование ФСК – фермент-субстратного комплекса;

3) распад ФСК с высвобождением продуктов реакции.

Главной особенностью ферментативных реакций является протекание в составе активного комплекса, образованного в результате связывания субстрата с определенным участком фермента (активным центром), к которому субстрат обладает сильным химическим сродством. Образуется фермент-субстратный комплекс (ФСК). В фазе ФСК происходит ферментирование (преобразование) субстрата, в результате чего высвобождаются продукты реакции (рисунок 3.3).

Рисунок 3.3 - Этапы ферментативного катализа: I - этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия; III - деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV- распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента.

Снижение концентрации изопарафинов вследствие протекания реакций ферментативного катализа (биотрансформации) рассмотрим на примере 4-метилдекана (рисунок 3.4).

На рисунке видно, что концентрация 4-метилдекана за 24 часа процесса биодеструкции снизилась в 2, 5 раза по сравнению с первоначальным содержанием. Полное исчезновение данного соединения наблюдается (как и всех изо-алканов вместе взятых) из системы спустя 9 суток.

Рисунок 3.4 - Снижение концентрации 4-метилдекана в процессе реакций ферментативного катализа

В ходе биотрансформации алифатических, циклических и изопарафиновых углеводородов в течение 216 часов происходит накопление ациклических непредельных углеводородов. На рисунке 3.5 показана динамика снижения доли олефинов связанное непосредственно с изменением концентрации парафинов, изопарафинов и нафтенов.

Рисунок 3.5 - Изменение концентрации олефинов

Изменение концентрации олефинов в системе происходит за счет химических превращений под воздействием дегидрогеназы, протекающими по следующей схеме:

дегидрогеназа

R-CH₂-CH₃ R-CH=CH₂ + H₂

Микробиологическое окисление алкенов включает следующие реакции:

а) окисление метильной группы с образованием ненасыщенных кислот;

б) образование эпоксидов по двойной связи;

в) образование диолов.

Ненасыщенные углеводороды могут окисляться одновременно и по метильной концевой группе и по двойной связи молекулы. Имеет место также терминальное и субтерминальное окисление, в результате чего образуются соответствующие ω -ненасыщенные кислоты, насыщенные кислоты, ω -ненасыщенные спирты, эпоксиды, диолы и т.д.

Параллельно с образованием олефинов в системе проходит накопление ароматических углеводородов, связанное со снижением концентрации легких фракций тремя путями:

1) дегидроциклизация алканов;

2) дегидрирование циклоалканов;

3) дегидрирование алкилзамещенных циклоалканов.

Процесс деструкции ароматических углеводородов ускоряется в смешанной микробной популяции, где степень окисления ароматических углеводородов ассоциацией микроорганизмов выше, чем отдельных компонентов чистыми культурами. Изучаемый биопрепарат «МД» является комплексным, т.е. содержит несколько культур углеводородокисляющих микроорганизмов, что способствует высокой скорости деструкции аренов.

Рисунок 3.6 - Динамика изменения доли ароматических соединений

Из рисунка 3.6 видно, что после накопления ароматических углеводородов в течение 24 часов происходит их дальнейшая деструкция, объясняемая процессами соокисления. Так, углеводороды, устойчивые к биодеструкции (например, полиароматические) исчезают из среды вследствие разрушения в условиях сопряженных окислительных реакций. Из рисунка видно, что через 24 часа концентрация ароматических углеводородов возросла в 87 раз. Затем наступает деструкция аренов, доказывающая способность консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов исследуемого биопрепарата «МД» к деструкции всех классов углеводородов.

Использование микроорганизмами алкилзамещенных ароматических углеводородов для роста достаточно естественно, хотя и не является обычным свойством микробных культур. На рисунке 3.7 показано изменение концентрации алкилзамещенных ароматических углеводородов на примере 1-этил-2-метилбензола и и-бутилбензола. Видно накопление веществ в течение первых суток с последующей деструкцией вследствие биотрансформации.

Рисунок 3.7 - Изменение концентрации алкилзамещенных аренов в процессе биотрансформации

Ассимиляция алкилпроизводных бензола – свойственна небольшому числу микроорганизмов. У разных организмов начальные этапы окисления алкилзамещенных аренов связаны или с первоочередным окислением алкильного радикала, или гидроксилированием ядра.

Алкилзамещенные ароматические углеводороды с длинной алифатической цепью окисляются микроорганизмами до кислот. При этом алифатическая цепочка служит источником углерода, фрагментируясь в процессе β -окисления, и редуцируется до одного, двух или трех углеродных атомов. Соответственно в культуральной среде накапливаются такие кислоты, как бензойная, фенилуксусная, фенилакриловая.

Также отслеживалась деструкция общего числа компонентов в системе. Изначально в нефтепродукте содержалось 98 углеводородов. На рисунке 3.8 изображена кривая изменения количества индивидуальных компонентов в смеси.

Рисунок 3.8 - Динамика снижения числа индивидуальных компонентов в смеси

Видно, что через 216 часов биодеструкции в системе их осталось 4, т.е. общее число компонентов уменьшилось в 25 раз. Остаточными углеводородами являются тяжелые парафины – преимущественно декан и пентадекан.

На более поздних стадиях деструкции в системе образуются кислородсодержащие органические соединения: эфиры (этил-трет-бутиловый эфир, трет-амиловый эфир, диизопропиловый эфир) и спирты (пропанол, бутанол).

Суммарно процесс биотрансформации углеводородов нефти на всем протяжении деструкции можно представить следующей схемой:

С помощью метода газовой хроматографии/масс-спектрометрии был проделан анализ метаболитов на содержание карбоновых кислот. Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на оборудовании Agilent 7890А. Это современнейший ГХ/МС, позволяющий получить больше информации об образце за один анализ за счет многомерной ГХ и разделения потока, направления образца одновременно на несколько детекторов. Функция продувки колонки в обратном направлении для любого капиллярно-потокового модуля повышало качество и сокращало время анализов; изменяли направление потока на обратное сразу после того, как элюируется последний интересующий компонент, таким образом, удаляя сильно удерживаемые вещества из колонки за короткое время, при этом предотвращая загрязнение колонки, детектора и источника ионов МСД, изменение времени удерживания.

Анализируемая смесь веществ в процессе пробоподготовки проходила стадию дериватизации посредством реакции этерификации.

Этерификация – реакция образования сложных эфиров при взаимодействии кислот и спиртов:

Механизм реакции

Реакция протекает в условиях кислотного катализа и проходит по механизму нуклеофильного замещения. На первой стадии происходит протонирование атома кислорода карбонильной группы карбоновой кислоты с образованием резонансно стабилизированного карбкатиона:

после чего происходит нуклеофильная атака атома кислорода гидроксильной группы спирта на карбониевый центр с образованием алкилоксониевого иона, эта стадия является лимитирующей. Затем в алкилоксониевом ионе происходит миграция протона на один из гидроксилов с образованием уходящей группы —O⁺H₂:

Завершающей стадией является отщепление промежуточного продукта присоединения воды и протона — катализатора с образованием сложного эфира:

Механизм реакции подтвержден экспериментом с использованием изотопных меток: при использовании спирта, меченного изотопом ¹⁸O, метка оказывается в составе сложного эфира:

Реакцию этерификации проводили в присутствии катализатора – серной кислоты. Для повышения выхода сложного эфира использовали избыток спирта.

В результате анализа методом газовой хроматографии получили хроматограмму (рисунок 3.9).

Рисунок 3.9 – Хроматограмма, полученная в результате анализа смеси метаболитов УОМ

Интересующий нас пик на хроматограмме соответствовал времени удерживания 12, 772 мин. В результате масс-детектирования получили масс-спектр сложного эфира карбоновой кислоты (рисунок 3.10).

Рисунок 3.10 – Масс-спектр метилового эфира пентадекановой кислоты

Сравнивая основные характеристические пики с m/z 55, 74, 87, 97, 143, 227 с пиками эталонного образца, делаем вывод о том, что в смеси обнаружены фрагменты пентадекановой кислоты. Это говорит о механизме биотрансформации веществ, где конечными продуктами являются альдегиды, карбоновые кислоты и их эфиры.

Параллельно в ходе исследования деструкции нефраса углеводородокисляющими микроорганизмами следили за численностью микроорганизмов. На рисунке 3.11 отображена динамика изменения численности микроорганизмов в процессе биодеструкции.

Рисунок 3.11 - Динамика изменения численности микроорганизмов

На полученной типичной кривой роста бактерий можно выделить 4 фазы. Лаг-фаза (24-264 часа) соответствует периоду физиологического приспособления, именно в этой фазе происходит биодеструкция парафинов, изопарафинов, ароматических углеводородов. Далее в системе образуются кислородсодержащие органические соединения, что соответствует экспоненциальной фазе роста бактерий (264-312 часов), характеризующейся максимальной скоростью клеточного деления. Период 312-456 часов соответствует стационарной фазе, в течение этого периода доступность важнейших питательных веществ становится лимитирующим фактором, устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и процессом отмирания клеток. После 456 часов наступает фаза отмирания, причиной которой являются накопление токсичных метаболитов и разрушение под действием собственных ферментов.