ТҚҰ туберкулез ауруын культуральдық әдістермен анықтау тәртібі

1. Диагностикалық материалды культуральдық зерттеу жұ мыртқ а қ осылғ ан Левенштейн-Йенсен қ атты қ оректік ортасында жү ргізіледі.
2. Диагностикалық материалдарды ө ң деуге арналғ ан ерітінділерді дайындауғ а қ ажетті барлық реактивтердің тазарту дә режесі «химиялық таза» (ХТ) санатына сә йкес болуы тиіс.
3. Зертханағ а келіп тү скен материал зерттеу жү ргізбес бұ рын зертханалық тіркеу журналында тіркеледі. Зерттеудің барлық тү рлерін жү ргізу ү шін ә рбір ү лгіге бір ғ ана зертханалық тіркеу нө мірі беріледі.
4. Қ оректік ортағ а себу алдында диагностикалық материалды деконтаминациялау (залалсыздандыру) ү шін арнайы ө ң деуден ө ткізеді.
5. Биологиялық сұ йық тық тар мен тіндерді стерильді флакондарғ а асептика ережелерін сақ тай отырып алғ ан болса, деконтаминация жү ргізу қ ажет емес: жұ лын, синовиальді жә не басқ а да жабық қ уыстардан алынғ ан сұ йық тық тар; сү йек майы; «суық» абсцесстерден алынғ ан ірің; резекцияланғ ан тіндер (аутопсия материалынан басқ а); бауыр мен лимфа бездерінен алынғ ан пунктаттар жә не биопсия материалдары (жыланкө з болмағ ан жағ дайда).
Қ ақ ырық деконтаминациясы екі ә діспен жү ргізіледі:
1) қ ақ ырық ты NaOH сілті ерітіндісімен ө ң деу, натрий цитратының 2, 9% ерітіндісі мен NALC ерітіндісін бірдей кө лемде қ осып. Деконтаминация емшарасы ВАСТЕС-ті ө ндірушінің нұ сқ ауына сә йкес жү ргізіледі. Содан кейін тү тіктерді суытатын қ ызметі бар центрифугағ а салып, 3000-3500g жылдамдық та 20 минут бойы центрифугалайды. Содан кейін тү тіктерді аэрозолі шө гу ү шін 5 минутке II классты қ ауіпсіздік шкафына салып қ ояды. Тұ нбаның бетіндегі сұ йық тық ты (супернатант) залалсыздандыратын ерітіндісі бар ыдысқ а абайлап қ ұ йып алады да, тұ нбағ а стерильді пастер тамызғ ышымен 0, 8-1, 0 мл стерильді фосфат буферін қ осады. Тұ нбаны тамызғ ыштың кө мегімен ақ ырындап араластырады да (қ атты араластыруғ а болмайды), қ оректік ортағ а себеді;
2) материалды бекітілген стандарттарғ а сә йкес кү йдіргіш натрдың 4% ерітіндісімен ө ң деу (модификацияланғ ан Петров ә дісі).
7. ТМБ қ атты қ оректік ортада 8 апта бойы инкубациялайды.
8. Диагностикалық материалды қ оректік ортағ а себудің нә тижелерін бағ алау:
1) келесі белгілер тіркеледі: ө сіндінің пайда болуы – ө су мерзімі, ө су қ арқ ыны – колониялар саны; себіндінің басқ а микрофлорамен немесе саң ырауқ ұ лақ тармен ластануы; ө судің болмауы;
2) апта сайын тексеру барысында ластанғ ан тү тіктерді (ө сім) алып, автоклавта немесе ө ртеу арқ ылы жояды.
9. Диагностикалық материалды қ оректік ортағ а себудің нә тижелерін есепке алу.
Себудің оң нә тижесі дә лелденеді:
қ атты қ оректік ортада кем дегенде 3-4 апта бойы инкубациялағ аннан кейін колониялардың ө суімен;
ө зіне тә н морфологиясы жә не тү сі бар колониялардың болуымен;
ө сіндіден Циль-Нильсен ә дісі бойынша жасалғ ан жағ ынды микроскопиясы кезінде қ ышқ ылғ а тө зімді микроорганизмдердің анық талуымен.
Ө су қ арқ ынын 4 баллдық жү йе бойынша бағ алайды:

Ө сіп шық қ ан микобактериялардың жоғ арыда аталғ ан барлық сипаттамалары зертханалық культуральдық зерттеу нә тижелерін тіркеу журналына, жауап бланкісіне, сонымен қ атар жеке есепке алудың компьютерлік дерекқ орына жазылады.

М. tuberculosis сә йкестендіруідің негізгі биохимиялық тесттері

10. Ө сіп шық қ ан микобактериялардың М. tuberculosis кешеніне жататынын арнайы зертханалық тесттер негізінде міндетті тү рде дә лелдеу қ ажет.
11. М. tuberculosis кешені микобактерияларын туберкулезді емес микобактериялардан бастапқ ы идентификациялау келесі культуральдық белгілер бойынша жү ргізіледі: қ атты қ оректік орталарда ө су жылдамдығ ы; пигмент тү зу; колониялардың морфологиясы; қ ышқ ылғ а тө зімділіктің болуы; ө су температурасы. М. tuberculosis кешеніне микобактериялардың келесі тү рлері жатады: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti. Оларды баяу ө сетін қ ышқ ылғ а тө зімді туберкулезді емес микобактериялардын ажырату ү шін келесі негізгі биохимиялық тесттер қ олданылады: никотин қ ышқ ылын бө лу мү мкіндігін анық тайтын тест (ниацинды тест); нитратредуктазды белсенділіктің болуын анық тайтын тест; термотұ рақ ты каталазаның болуын анық тайтын тест; салицил қ ышқ ылды натрийі (1 мг/мл) бар ортада ө су тестті (немесе паранитробензой қ ышқ ылының 500 мкг/мл мө лшері бар ортада ө су тестті; 5% натрий хлориді бар ортада ө су тестті).
12. М. tuberculosis жә не М. bovis ажырату ү шін келесі сынамалардың нә тижелері есепке алынады: ниацинды тест; нитратредуктазаның бар болуын анық тайтын тест; пиразинамидазаның бар болуын анық тайтын тест; молекулалы-генетикалық зерттеумен тү рін анық тау (Geno Type MTB® DR).

ТМБ ТҚ П сезімталдық тестін қ атты қ оректік орталарда анық тау

13. ТМБ туберкулезге қ арсы қ олданылатын бірінші жә не екінші қ атардағ ы дә рілерге сезімталдығ ын Левенштейн-Йенсен (бұ дан ә рі – Л-Й) қ оректік ортасында пропорция ә дісімен анық тайды.
14. ДСТ пропорция ә дісімен анық тау ү шін Л-Й ортасы қ олданылады, тест жү ргізіліп отырғ ан штаммдардың тө зімділігі дә рілері бар ортада ө сіп шық қ ан колониялар санының дә рілері жоқ ортада ө сіп шық қ ан колониялар санына қ атынасы ретінде есептеледі. Бұ л кө рсеткіш тіршілікке қ абілетті колония тү зетін бірліктердердің (бұ дан ә рі - КТБ) жалпы популяциясындағ ы тө зімді мутанттар пайызын анық тауғ а мү мкіндік береді.
15. ДСТ қ атты қ оректік ортада пропорция ә дісімен бекітілген стандарттарғ а сә йкес жасалады.
16. Л-Й ортасындағ ы дә рілік заттардың сыни концентрациялары:
Изониазид - 0, 2 мкг/мл; Стрептомицин - 4, 0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2, 0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1, 0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.
17. Дә рілері бар қ оректік ортаны дайындау барысында ө ндірушіге сә йкес дә рілердің бір партиясынан/сериясынан келесісіне ө згеріп отыруы мү мкін дә рілердің белсендігін ескеру қ ажет. Бұ л мә ліметтер контейнерлердің сыртындағ ы заттаң бада, орауышында жазылуы мү мкін немесе ө ндірушінің ө зі хабардар етеді.
18. Тү тіктерді термостатта ең кейтіп, қ ақ пағ ын тығ ыздап жаппай, 37⁰ C температурада дә рісіз қ оректік ортада кө зге кө рінетін ө сінді пайда болғ анғ а дейін, содан кейін 4-6 апта бойы ауызын бітеп сақ тайды.
19. Нә тижесін бағ алау. Тө зімділіктің болуына нұ сқ айтын белгі – барлық дә рілер ү шін бактериальды популяцияның 1, 0% ө суі. 4 апта бойы инкубациядан кейін дә рісі жоқ ортадағ ы 10-4 суспензиядан егілген ө су қ арқ ынын дә рісі бар ортадағ ы 10-2 суспензиядан егілген ө су қ арқ ынымен салыстырады. Егер дә рісі бар ортадағ ы колониялар саны кө бірек болса (1% тең немесе артық), тест жү ргізілп отырғ ан штамм тө зімді болып саналады.

ТҚ Ұ зертханаларында автоматтандырылғ ан BАСТЕС MGIT-960 жү йесінде сұ йық қ оректік орталарды қ олдана отырып туберкулез ауруын культуральдық ә дістермен анық тау тә ртібі

1. Туберкулез ауруын сұ йық қ оректік орталарда культуральдық ә діспен автоматтандырылғ ан BАСТЕС MGIT-960 жү йесін қ олдана отырып анық тайды. ТМБ ө скен жағ дайда (1 мл ортада 105-106 КТБ дейін) аспап сынаманы оң нә тижелі деп бағ алап, жарық пен немесе дыбыспен белгі береді. 6 апта (42 кү н) бойы ө су байқ алмаса, аспап сынаманы теріс нә тижелі деп бағ алайды.
2. Сұ йық қ оректік орталардағ ы культуральдық ә діс емшарасы бекітілген стандарттарғ а сә йкес жү ргізіледі.
3. Сұ йық қ оректік орталарғ а себу II классты қ орғ анысты ламинарлы боксте жү ргізіледі. Тү тіктерді жұ мыс алдында таң балайды, таң ба жазуы тү тіктердің штрих-кодына тү спеуін ерекше қ адағ алау қ ажет.
4. Теріс нә тижелі тү тіктердегі қ оректік орталарда ө згеріс байқ алса, одан жағ ынды жасап, микроскопиялық зерттейді жә не материалды қ анды агар (ластануды бақ ылау ү шін) мен Левенштейн-Йенсен ортасына себеді.
5. Оң нә тижені дә лелдеу мақ сатында ә р MGIT тү тігінен жағ ынды жасап, оларды жалпы нұ сқ ауғ а сә йкес Циль-Нильсен ә дісімен бояйды. Қ ышқ ылғ а тө зімді «бұ рым» тә різді колониялар туберкулез микобактерияларының бар екендігіне нұ сқ айды. Жеке орналасқ ан қ ышқ ылғ а тө зімді бактерия жасушалары анық талса, ө сіндіні идентификациялау қ ажет.
6. Егер аспап оң нә тижелі деп бағ алағ ан тү тіктен жасалғ ан жағ ынды микроскопиясы теріс нә тижелі болса, ал қ оректік ортаның ө зі мө лдір болса жә не оның ластанғ анына кү дік болмаса, тү тікті жү йеге тағ ы қ осымша 3 кү нге салып қ ояды. Содан кейін жағ ынды микроскопиясын қ айталайды. Қ айтадан жасалғ ан микроскопия теріс нә тижелі болса, ортаны кө збен қ арап тексергенде ө судің жә не ластанудың белгілері болмаса (қ анды агарда ө су байқ алмаса), сонымен қ атар Л-Й ортасында 10 апта бойы ө су белгілері болмаса, сынама теріс нә тижелі болып саналады.
7. Ластанудың мү мкін дең гейі қ атты қ оректік орталар ү шін 3-5%, сұ йық қ оректік орталар ү шін – 7-8%.
8. Микобактериялар тү рін ажыртау ү шін келесі белгілер қ олданылады:
1) ө су қ арқ ыны: M.tuberculosis, M. bovis жә не белгілі дә режеде M.kansasii туберкулезді емес микобактериялармен салыстырғ анда баяу ө седі;
2) сұ йық ортада ө скен жағ дайда ТМБ тү йіршік тә різдес болады, туберкулезді емес микобактериялардың кө бі ортаны біртегіс аздап лайландырады (M. Kansasii-ден басқ алары);
3) оң нә тижелі MGIТ ортасынан жасалғ ан жағ ындыда туберкулезді микобактериялар кешені/жиынтығ ы айқ ын ұ йысулар мен жылан тә різдес жіптер (корд-фактор) тү зеді, ал туберкулезді емес бактериялар жеке-жеке кішігірім ұ йысулар мен жіптер немесе бірен-саран жасушалар тү зеді.
9. ДСТ қ ою:
1) ТМБ туберкулезге қ арсы қ олданылатын бірінші жә не екінші қ атардағ ы дә рілерге сезімталдығ ын BАСТЕС MGIT – 960 аспабында пропорция ә дісі негізінде анық тайды. ДСТ ү шін қ атты қ оректік орталармен салыстарғ анда ТҚ П таза субстанцияларының тө мендеу шоғ ырлануын қ олданады (сезімталдық тың жалғ ан нә тижесінен сақ тану ү шін): стрептомицин – 1, 0 мкг/мл; изониазид – 0, 1 мкг/мл; рифампицин – 1, 0 мкг/мл; этамбутол – 5, 0 мкг/мл;
2) ДСТ BАСТЕС MGIT-960 ү шін бекітілген нұ сқ ауларғ а сә йкес жасалады;
3) себінді жасалғ ан тү тіктер дә ріге сезімталдық ты анық тауғ а арналғ ан арнайы ұ стағ ыштарғ а қ атаң тә ртіппен қ ойылады: бақ ылау, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.
10. Нә тижелерді есепке алу: тест аяқ талғ ан соң (14-21 кү н ішінде) аспапта нә тиженің дайын болғ ану туралы қ абарлама пайда болады. Оларды алу ү шін ұ стағ ыштағ ы штрих-кодты сканирлеп, есепті басып шығ арады, онда ә рбір дә рілік заттың ДСТ жазылады: сезімтал (S); резистентті (R), тест нә тижесі анық талғ ан жоқ немесе қ ате жіберілді (X).
Аспап бақ ылаудағ ы ө су бірліктерінің (GU) мө лшері 400 жеткенде (4-13 кү н ішінде) нә тижелерін оқ и бастайды. Дә рісі бар тү тіктегі ө су кө рсеткіштерін бағ алау:
S – дә рісі бар тү тіктегі ө су бірлігі 100 кем емес;
R – дә рісі бар тү тіктегі ө су бірлігі 100-ге тең жә не одан артық;
Х – тест емшарасына ә сер ететін кейбір жағ дайларда байқ алатын тү сініксіз нә тижелер (мысалы, бақ ылау ү лгісіндегі ө су бірлігі 4 кү ннен аз уақ ытта > 400). Бұ ндай жағ дайда тестті M. tuberculosis жиынтығ ы деп дә лелденген, таза, белсенді ө сіп жатқ ан ө сіндімен қ айталау керек.
Кейбір дә ріге тө зімді штаммдар қ оректік ортада ө те баяу ө седі де, стандартты егу барысында 13 кү н ішінде нә тиже алу мү мкін болмайды. Бұ ндай жағ дайда зерттеуді қ айталау қ ажет.
Есеп беру: дә ріге сезімталдық ты зерттеу нә тижелері дайын болғ ан бетте бірден клиникалық бө лімшелерге жіберіледі. Нә тиже қ олданылғ ан ә дісті, дә рі тү рін жә не оның шоғ ырлануын кө рсете отырып, «сезімтал» немесе «резистентті» деп белгіленеді.
11. Пиразинамидке сезімталдық тесттілері:
1) пиразинамидке ДСТ анық тауда ортадағ ы рН дең гейін сақ тауғ а ерекше талап қ ойылады (in vitro пиразинамид тек қ ышқ ыл ортада ғ ана белсенді) жә не BАСТЕС MGIT - 960 аспабы ү шін ортаның рН кө рсеткіші 6, 0 аспайтын тест ә зірленген; рН мө лшерінің орнын толтыру ү шін пиразинамидтің концентрациясы 100 мкг/ мл дейін кө бейтілген;
2) BАСТЕС MGIT-960 аспабындағ ы пиразинамидке ДСТ бекітілген стандарттарғ а сә йкес жү ргізіледі.
12. Екінші қ атардағ ы дә рілерге ДСТ.
Екінші қ атардағ ы дә рілерге ДСТ анық тауғ а арналғ ан дайын жиынтық тар жоқ.
Реагенттер: екінші қ атардағ ы ТҚ П субстанцияларының сыни шоғ ырланулары есептеледі. Дистилденген сумен немесе арнайы еріткішпен ерітілген дә рілерді автоматты тамызғ ының кө мегімен 0, 1мл-ден (100 мкл) таң баланғ ан MGIT тү тіктеріне қ ұ йылады. ДСТ арналғ ан ө сіндіні дайындау жә не тесттің ө зі жоғ арыда сипатталғ ан бірінші қ атардағ ы ТҚ П сезімталдық ты анық тау емшарасымен бара-бар жасалады.
Екінші қ атардағ ы ТҚ П шоғ ырланулары: амикацин – 1, 0 мкг/мл; капреомицин – 2, 5 мкг/мл; офлоксацин – 2, 0 мкг/мл; этионамид – 5, 0 мкг/мл.
Есептеу кезінде 1 г субстанциядағ ы белсенді заттың мө лшері ескеріледі:
1) офлоксацин мен этионамидті бірінші рет диметилсульфоксидпен (DMSO) ерітеді.
2) сақ тауғ а арналғ ан дә рілерді кем дегенде 0, 5 мл (3-4 ДСТ) мө лшерде алу керек, ө йткені сақ тау барысында олардың шығ ыны болады.

Туберкулез ауруын жә не дә ріге сезімталдық ты анық таудың молекулалы-генетикалық ә дістерін (Geno Type ®MTBDR, Xpert MTB/RIF) қ олдану тә ртібі

1. Рифампицинге тө зімділік РНК белсенділігіне жауапты жалғ ыз rpoB генінде кодталғ ан, изониазидке тө зімділік бірден тө рт гендегі мутациялармен бақ ыланады – katG, inhA, ahpC жә не oxyR, GenoType ® MTBDR plus-тест жиынтығ ы қ олданылады.
2. Рифампицинге тө зімділікті анық тау rpoB (РНК полимеразаның бета-суббірлігінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анық тауғ а негізделген. Изониазидке жоғ ары дең гейдегі тө зімділік katG (каталаза-пероксидазаның бө лінуінің кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анық тауғ а негізделген болса, бұ л дә ріге тө зімділіктің тө менгі дең гейі inhA (NADH-Enoyl-АТФ-редуктазаның кодына жауапты) геніндегі мутацияларды анық тауғ а негізделген.
3. GenoType ® MTBDR sl-тест жиынтығ ы 2 кү н ішінде ТМБ аминогликозидтер мен фторхинолондарғ а тө зімділікке жауапты гендеріндегі мутацияларды анық тауғ а мү мкіндік береді, яғ ни бактериаологиялық анализдердің нә тижесі дайын болғ анғ а дейін кө п бұ рын науқ астарда ДАТ ТБ бар екендігін анық тауғ а мү мкіндік береді.

Гендік-молекулалық Xpert MTB/RIF технологиясы

4. Xpert MTB/RIF – нақ ты уақ ытта полимерлі тізбекті реакцияны (ПТР) іске асыратын толық автоматтандырылғ ан жү йе, соның нә тижесінде 2 сағ ат ішінде ТМБ жиынтығ ының ДНК детекциясы мен рифампицинге тө зімділікке жауапты rpoB геніндегі мутациялар бірдей анық талады.
5. GeneXpert жү йесіне компьютер, штрих-кодты оқ итын сканер жә не қ ұ рамында зерттеу жү ргізуге қ ажетті реагенті бар бір рет қ олданылатын картридждер кіреді.
6. Зерттеуге болатын материалдар: қ ақ ырық, БАС, жұ лын сұ йық тығ ы, лимфа бездері немесе басқ а тіндер.
7. Зерттеуге қ ажетті қ ақ ырық мө лшері – 3-5 мл. Ә рбір ү лгі дұ рыс таң балануы тиіс, кем дегенде ә мбебап сә йкестендірме нө мірі жазылуы керек. Бұ л нө мір сонымен қ атар зерттеуге жолдамағ а жә не зертханалық журналғ а тіркеледі. Ү лгіде тағ ам қ алдық тары немесе басқ а да қ атты қ оспалар болмауы тиіс.
8. Xpert MTB/RIF-ке қ ажетті картридждер мен реагенттер 2–280C температурада сақ талуы тиіс. Картридждердің орамасын ашқ аннан кейін 7 кү н ішінде ө зінің тұ рақ ты қ асиеттерін сақ тайды.
9. Реагенттер мен картридждердің жарамдық мерзімі ө ткен соң қ олданылмайды.
10. Есепке алу, тіркеу жә не есеп беру. Нә тиже тө мендегідей болып беріледі:
ТМБ анық талғ ан жоқ (теріс нә тиже);
ТМБ анық талды, Rif resistance анық талғ ан жоқ (оң нә тиже, рифампицинге сезімтал);
ТМБ анық талды, Rif resistance анық талды (оң нә тиже, рифампицинге тө зімді);
ТМБ анық талды, Rif resistance анық талмады (оң нә тиже, рифампицинге тө зімділікті анық тау мү мкін болмады, бұ л микроб жасушасының гендік материалының жеткіліксіз болғ анына нұ сқ айды).