Механизмы резистентности

· У микроорганизма может отсутствовать структура, на которую действует антибиотик (например, бактерии рода микоплазма (лат. Mycoplasma) нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки);

· Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной);

· Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки (лат. Staphylococcus) содержат фермент β -лактамазу, который разрушает β -лактамовое кольцо большинства пенициллинов);

· В результате генных мутаций, метаболизм может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком биохимические реакции или мишени больше не являются критичными для выживания данного микроорганизма.

В 2002 году в Канаде была принята Всемирная декларация по борьбе с антимикробной резистентностью, в которой указывается, что резистентность к антибиотикам коррелирует с их клинической неэффективностью, она создается человеком, и только человек может решить эту проблему, а необоснованное применение антибиотиков населением, неправильные представления и недооценка проблемы резистентности врачами и фармацевтами, назначающими антибиотики, может привести к распространению резистентности.

Существует несколько путей преодоления резистентности бактерий к антибиотикам. Один из них — это защита известных антибиотиков от разрушения ферментами бактерий или от удаления из клетки посредством мембранных насосов.

Первый подход основан на использовании «защищенных» полусинте-тических пенициллинов и цефалоспоринов. Защита антибиотика заключа-ется в замене ацильных остатков, присутствующих в природных антибио-тиках на другие. Такая замена изменяет пространственное строение молеку-лы и препятствует ее взаимодействию с активным центром бетта-лактамаз.

Второй подход основан на использовании специальных веществ- ингибиторов бета-лактамаз, проявляющих в низких концентрациях ингибиторную активность, а в высоких — обладающих антибактериальными свойствами. Примером может служить клавулановая кислота, галогенизированные пенициллановые кислоты, сульфон пенициллановой кислоты (сульбактам). Клавулановая кислота и сульбактам блокируют гидролиз пенициллина стафилококками. Наиболее широко используют в качестве ингибиторов бета-лактамаз клавулановую кислоту и сульбактам.

Перспективными подходами к преодолению резистентности бактерий к антибиотикам представляются также применение комбинаций антибиотиков; проведение целевой и узконаправленной антибактериальной терапии; синтез новых соединений, относящихся к известным классам антибиотиков; поиск принципиально новых классов антибактериальных препаратов.

2. При получении БАВ растительного происхождения можно использовать в качестве источника сырья резервы дикой природы, плантационные культуры и культуры растительных клеток. Определите возможности и преимущества биотехнологического процесса получения ЛС с помощью культур растительных клеток?

ЛС биотехнологическим способом из культуры растительных клеток получают после выращивания каллусных тканей с использованием специальных методов.

Достоинства способа:

1. Отсутствие влияния климатических, сезонных и географических факторов;

2. Сокращение использования посевных площадей под выращивание лекарственных растений;

3. Возможность получения как известных веществ (хинин, кодеин и др.), присущих интактному растению, так и синтез новых веществ не синтезируемых соответствующим целевым растением;

4. Использование клеточных культур для биотрансформации полученных продуктов;

5. Решение проблем дефицита исходного ЛРС, ценных и исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию;

6. Более высокое качество и стандартность получаемого сырья по содержанию целевого продукта;

6. Получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, радионуклидов и тяжелых металлов;

7. Возможность управления биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и др. способами;

8. Возможность индустриализации и удешевление производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

3. Проанализируйте на конкретных примерах преимущества биотехнологического производства витаминов?

Витамины (от лат. vita – жизнь + амины) – низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, абсолютно необходимые для нормальной жизнедеятельности организмов. Витамин являются незаменимыми компонентами, т.к. за исключением никотиновой кислоты они не синтезируются организмом человека и поступают главным образом в составе продуктов питания. В отличие от других жизненно важных пищевых веществ витамины не обладают пластическими свойствами и не используются организмом в качестве источника энергии. Участвуя в разнообразных биохимических превращениях, они оказывают регулирующее влияние на обмен веществ и тем самым обеспечивают нормальное течение практически всех биохимических и физиологических процессов в организме.

Многие коферменты являются производными витаминов и, поэтому нарушение обмена веществ при витаминной недостаточности опосредовано через понижение активности определенных ферментов.

Традиционные способы получения витаминов основаны либо на переработке больших количеств ценного и часто очень редкого, растительного или животного сырья, либо (в редком случае) на химическом синтезе, следовательно, витаминная промышленность нуждается в более эффективных технологиях, и такие технологии успешно создаются.

С помощью генно-инженерных манипуляций (воздействием на регуляцию метаболизма) были получены штаммы микроорганизмов, которые производят в десятки тысяч раз больше витаминов, чем необходимо для их роста. Это штаммы Ashbya gossypii – продуцент рибофлавина, штаммы Pseudomonas denitrifikans и Propionibacterium freudonreichii, производящие витамин В12 и др. В России на базе бактерий рода Bacillus subtilis сконструирован эффективный продуцент витамина В2.

Помимо широкого применения в медицине в качестве профилактических и лечебных средств, получаемые микробиологическим путем витамины В2 и В12 добавляют в пищу животным для сбалансирования кормов.

Получение витамина В12.

Витамин В12 очень важен в коррекции определенных нарушений в организме человека и животных. Он регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование гемоглобина, применяется для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени и в других случаях.

В 1972 г. в Гарвадском университете был осуществлен химический синтез витамина В12, включающий 37 стадий его получения, что лишало возможности организовать рентабельное промышленное производство этого витамина. Поэтому раньше витамин В12 получали исключительно из природного сырья (1тонна печени – 15 милиграмм витамина). Единственный способ его получения в настоящее время – это микробиологический синтез в промышленном масштабе. Продуцентом витамина В12 являются пропионовокислые бактерии из рода Propionibacterium. Применение мутантов и добавление в среду предшественника витамина В12 - 5, 6 диметилбензимидазола (5, 6 ДМБ) резко повышает продуктивность продуцента. Этому способствует также добавление в питательные среды кукурузного и мясного экстракта, соевой муки, рыбной муки. Выращивание пропионовых бактерий производится периодическим методом в анаэробных условиях на среде с кукурузным экстрактом, глюкозой, солями кобальта и сульфатом аммония. Образующиеся кислоты нейтрализуются щелочью. Через 72 часа после начала ферментации вносят предшественники - 5, 6 ДМБ. Длительность ферментации – трое суток. Полученную массу сепарируют, стабилизируют нитритом натрия, охлаждают, нейтрализуют, коагулируют белки и фильтруют. Очищают на ионообменной смоле, кристаллизуют и проводят химическую очистку продукта. Далее следует получение различных лекарственных форм поливитаминных препаратов. Для увеличения производства витамина В12 перспективным является применение генной инженерии при получении гибридных штаммов и использовании методов иммобилизации на полимерах.

Другим примером использования биотехнологии в производстве витаминов является получение аскорбиновой кислоты.Промышленное производство аскорбиновой кислоты представляет собой комбинированный процесс, включающий в себянесколько стадий химического синтеза и одну стадию биотрансформации d -сорбитола в L-сорбозу, осуществляемую с помощью уксуснокислых бактерий.

4. В биотехнологическом производстве лекарственных средств, в частности для получения алкалоидов, довольно часто морфологическая специализация клеток является основной предпосылкой для активного синтеза. Какова связь между количественным выходом алкалоидов и свойствами каллусной культуры клеток?

Способность культур тканей растений к синтезу и накоплению вторичных метаболитов является установленным фактором. Однако для многих культур до сих пор не удается определить условия накопления продуктов, хотя бы в количествах, характерных для родительских растений. Как правило, клеточные культуры, напрямую полученные из растений, характеризуются низким содержанием искомых веществ. Это связано с тем, что в растениях обычно синтез и накопление вторичных метаболитов разобщены во времени и происходят в разных органах или тканях, а синтез их в недифференцированных тканях сильно репрессирован или вообще невозможен. Только благодаря использованию методов селекции и правильно разработанной технологии культивирования высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы их получение было рентабельным с экономической точки зрения.

Обычно в качестве источника клеток для получения культуры ткани проводят поиск наиболее продуктивных растений в надежде, что эта способность будет перенесена и в культуру. Однако однозначной зависимости между продукционной способностью растения и клеточной культуры, полученной из него обычно не наблюдается.

В настоящее время большое число экспериментальных данных свидетельствует о том, что образование и накопление вторичных продуктов в растениях - сложный, пространственно и повременно организованный процесс, который часто в той или иной форма включает транспорт этих соединений на клеточном и субклеточном, уровнях. В целом ряде случаев показано резкое разграничение мест первичного синтеза и накопления алкалоидов. Установлено, что, эти два процесса могут быть локализованы в различных клетках в пределах одного и того, же органа или даже одной и той же ткани.

В культурах тканей растений также как и в растениях, накопление вторичных метаболитов зачастую тесно связано с процессом вторичной тканевой дифференциации. В таких культурах обычно наблюдается формирование секреторные канальца, млечники, слизевые клетки, железки или специализированные клетки, где накапливаются конечные продукты, т.е. происходит процесс разобщения синтеза и накопления вторичных веществ. В недифференцированных клетках и тканях синтез таких продуктов сильно репрессирован.

Установлено, например, что практически все клетки в каллусе Macleyamicrocarpa обладают способностью синтезировать изохиноликовые алкалоиды, однако их накопление осуществлялось лишь в специализированных, так называемых " алкалоидных" клетках.

Исследователи, работающие с культурами тканей, неоднократно наблюдали, что при образовании в каллусной ткани морфологических структур (побегов, корней, эмбриоидов и т.д.) содержание искомых продуктов в культуре увеличивается. Например, культура ткани Atroра belladonna при недифференцированном росте не продуцировала гиосциамин, а при образовании корней в каллусе, начинается синтез алкалоида. Сердечные гликозиды наперстянки синтезировались только при образовании в культуре ткани эмбриоидов.

5. Для эффективного проведения биотехнологического процесса большое значение имеет питательная среда, в которой микроорганизмы-продуценты БАВ используют в качестве источника азота различные азотсодержащие соединения, содержащие аминный азот или ионы аммония. Какие условия проведения ферментации по источнику азота при получении антибиотиков будут являться оптимальными?

Соединения - источники азота усиливают рост биомассы продуцентов беталактамных, полиеновых антибиотиков (эритромицин, рифамицины), но отрицательно влияют на биосинтез самих антибиотиков. Поэтому выращивание продуцента антибиотика на начальных этапах ферментации в обедненных азотсодержащими соединениями средах нецелесообразно из-за малой скорости накопления биомассы в трофофазе.

Увеличению биосинтеза антибиотиков в идиофазе способствует значительное уменьшение в среде источников азота, особенно легкоусвояемых. При этом происходит дерепрессия ферментов синтеза антибиотиков.

6. Известно, что многие ценные лекарственные растения нельзя культивировать в России из-за климатических условий. Предложите возможности решения этой проблемы с помощью биотехнологии?

Для растений возможно культивирование растительных клеток или тканей растения на искусственной питательной среде в биореакторах. Использование данных технологий получения биомассы в виде каллусных или суспензионных культур имеет ряд преимуществ: стандартность накапливаемого сырья, высокий выход целевых продуктов, возможность промышленного производства биомассы клеток экзотических и малодоступных растений.

Метод начинается с процесса получения культуры каллусной ткани из экспланта растения. Далее проводят наработку биомассы клеток методом поверхностного (каллус) или глубинного (суспензионного) культивирования и затем с помощью различных физических, химических и биохимических методов инициируют наработку целевого продукта в клетках.

Для успешного культивирования необходимо учитывать как влияние физических и химических факторов на рост растения, так и физиологические характеристики клеток на уровне фенотипа и генотипа.

7. Суперпродуцент – это биообъект промышленного использования. Основные подходы к получению суперпродуцентов. Какими свойствами он должен обладать в отличие от природного штамма культуры?

Суперпродуцент (superproducer) [лат. super — сверху, над и producentis — производящий, создающий] — микробный или дрожжевой штамм-продуцент, обеспечивающий биосинтез определенного продукта в значительно более высокой, по сравнению с природными штаммами концентрации, который может быть использован для эффективного промышленного микробиологического производства этого продукта.

Производственные штаммы с высокой продуктивностью крайне нестабильны, так как многочисленные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют соблюдения асептических условий и постоянного контроля при хранении и культивировании.

Получают суперпродуценты методами мутагенеза, селекции или клеточной и генетической инженерии. У продуцентов антибиотиков повышают их резистентность к образуемым ими же антибиотикам.

8. При получении антибиотиков в процессе ферментации в питательной среде возможно избыточное или недостаточное содержание глюкозы.

Для каждого штамма продуцента подбирается оптимальный состав питательной среды. Углевод катаболитная реакция (глюкозный эффект) является одним из механизмов, влияющих на синтез вторичных метаболитов. Продукты катаболизма глюкозы подавляют не активность ферментов биосинтеза антибиотика, а сам синтез ферментов (катаболитическая репрессия). Глюкоза сильный репрессор, т. к. она представляет собой легко усваиваемый источник углерода и энергии для клетки. Поэтому катаболизм глюкозы резко снижает биосинтез антибиотиков (беталактамов, аминогликозидов и др.), т. к. клетки находятся в условиях трофофазы. Для максимального выхода целевого продукта — вторичного метаболита, необходимо оптимальное содержание глюкозы в питательной среде, достаточное для наработки нужного количества биомассы продуцента. Наряду с глюкозой в питательных средах должны содержаться более трудно усваиваемые сахара. Переключение метаболизма на них и служит спусковым механизмом для начала синтеза антибиотика.

9. Как можно оптимизировать условия ферментации для получения максимального количества целевого продукта - антибиотика?

Все продукты клеточного метаболизма условно можно разделить на первичные и вторичные метаболиты. К вторичным метаболитам (идиолитам) они относят различные специфические соединения, которые могут образовываться как ответ на воздействие различных внешних факторов, которые приводят к нарушению нормальных метаболитических процессов (антибиотики, стероиды, алкалоиды). К таким неблагоприятным факторам относятся нехватка питательных веществ, загрязнение культуральной среды продуктами метаболизма, добавление различных токсичных веществ и т.д. Синтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит не всегда, а лишь в определенных условиях, обычно неблагоприятных для клеток (обычно с конца Log-фазы и до конца фазы отмирания).

Процесс промышленного биосинтеза идиолитов проходит две фазы или стадии (двустепенчатое культивирование), резко различающиеся по условиям проведения. Во время первой фазы (трофофазы) основной задачей является накопление максимально возможного количества биомассы, которая выращивается на среде оптимальной для роста данного микроорганизма (ростовая среда). Из экономических и технологических соображений эта фаза должна быть максимально быстрой, а питательная среда дешевой и содержать легко усваиваемые субстраты (глюкоза, фруктоза). На второй фазе создаются условия обеспечивающие запуск и активный синтез вторичного метаболита. На этой фазе ферментацию обычно ведут на так называемой продуктивной среде, которая по своему составу значительно отличается от ростовой, т.к. содержит, в основном, трудноусваиваемые углеводы. Переключение клеток с легко усваиваемых субстратов (глюкоза) на более сложные (лактоза, сахароза) требует синтеза большого количества новых индуцибельных ферментов, что является для клеток “встряской”, аналогичной той, которую может испытать человек при резком торможении или маневре на автомобиле, который двигался с большой скоростью. Наработанная на первом этапе (в трофофазе) клеточная культура может быть перенесена (пересеяна) на продуктивную среду в другом аппарате или культивирование может осуществляться на сложных питательных средах, содержащих как легкоусваиваемые, так и трудноусваиваемые компоненты. Поскольку в структуру молекул многих вторичных метаболитов кроме углерода, водорода и кислорода входит значительное количество азота, серы, фосфора, то в состав продуктивных сред обязательно нужно добавлять в необходимых количествах нитраты, соли аммония и фосфорной кислоты и другие микроэлементы. Существует целый ряд физических (температура, рН, освещение светом определенной длины волны и интенсивности) и химических (добавление веществ-предшественников, поддержание определенной, обычно высокой концентрации кислорода) факторов благоприятствующих синтезу вторичных метаболитов.

Основной способ получения - направленный биосинтез антибиотиков, осуществляется путем культивирования (прямой ферментации) подходящего микроорганизма - продуцента. Точный механизм индуцирования первичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, до конца не расшифрован, однако известно, что биосинтез антибиотиков, как и любых других вторичных метаболитов, начинается в фазе замедленного роста клеточной популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в идиофазе. Считают, что в конце трофофазы (середина и конец стационарной фазы) в клетках и культуральной среде происходит накопление избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, некоторые из которых выступают в роли индукторов вторичного метаболизма, освобождающих гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболитной репрессии. Другим, важным стрессовым фактором, индуцирующим гены вторичного метаболизма, является резкое уменьшение содержания или полное исчерпание в питательных средах легкоусваиваемого компонента - глюкозы, что заставляет клетки переключаться на усвоение более сложных субстратов (другие моносахариды, дисахариды, полисахариды). Необходимость синтеза большого количества индуцибельных ферментов в условиях нехватки питания и как следствие промежуточных метаболитов, существенно дезорганизует процессы нормального метаболизма и запускает различные механизмы адаптации, в том числе и синтеза антибиотиков.

Специальные опыты показали, что выход цефалоспорина С уменьшается при переходе от использования в качестве источника углерода сахарозы к быстро усваиваемому углеводу глюкозе. Наиболее оптимальной средой для образования антибиотика культурой Streptomyces antibioticus оказалась смесь 0, 1 % глюкозы и 1 % галактозы. При таком соотношении моносахаридов глюкоза быстро утилизируется и микроорганизм переключается на усвоение галактозы, что и инициирует идиофазу.

10. Проведите сравнительную характеристику каллусных и суспензионных культур при использовании их в качестве субстрата для получения БАВ биотехнологическими методами?

Каллусные культуры выращивают на поверхности твердых питательных сред и в дальнейшем используют для синтеза соединений всех классов. Выход продуктов более высок, чем при синтезе в самих растениях.

Технология каллусных клеток имеет такие преимущества, как надежность и

стабильность при выходе биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможностью использования каллусных клеток для иммобилизации и суспензионного культивирования. Недостаток – применение значительного количества ручного труда.

Суспензионное культивирование — разновидность глубинного культивирования. В отличие от микроорганизмов, растительные клетки не могут расти в одиночном состоянии, а образуют в растворе агрегаты, состоящие из десятков и сотен клеток. Такие частицы можно наблюдать невооруженным глазом. По сравнению с суспензионными культурами выход продуктов метаболизма выше именно у каллусных систем, но управление процессом культивирования легче при работе с суспензионными культурами.

Однако выращивание культур в биореакторах глубинным способом дает возможность получение большего количества биомассы и кроме того, этот метод культивирования позволяет механизировать большую часть операций.

11. Известно, что в условиях биотехнологического производства природные продуценты БАВ должны быть генетически модифицированы. Как решается данная проблема в плане эффективности и безопасности получаемых ЛС?

Безопасность на генетическом уровне означает, что в геном продуцента чужеродного белка вносятся определенные изменения – удаляются гены, участвующие в синтезе определенной аминокислоты или витамина. Поэтому вне специальной питательной среды содержащей эти соединения в готовом виде микроорганизм не размножается и опасность заражения мала. Другим вариантом является использование термофильных штаммов, способных расти только при температуре выше 35⁰С. Эффективность генномодифицированных продуцентов при ферментации и наработке вторичных метаболитов доказана повышением выхода целевых продуктов.

12. Известно, что в фармацевтическом производстве широко используются биокатализаторы-ферменты. В чем заключается преимущество процессов биотрансформации перед процессами, основанными на химических превращениях?

Микробная трансформация-естественное свойство микроорганизмов, широко распространенное в природе. Это свойство используется человеком в практической деятельности для получения ценных продуктов. Таким образом, микробы могут выполнять роль химических реагентов в органической химии. Поэтому микробную трансформацию, когда она используется в этих целях, называют ферментативной, микробной или микробиологической химией. Действительно, цели и подходы микробной трансформации близки целям и методам органической химии.

В микробной химии используются не только процессы трансформации, осуществляемые микроорганизмами в природе или в стандартных условиях культивирования но, различные биохимические, генетические, микробиологические и технологические методы воздействия на метаболизм микробной клетки, позволяющие препаративно получать продукты неполного превращения органических соединений, используя микроорганизмы, у которых в обычных условиях способность осуществлять данную трансформацию не выражена.

Таким образом, огромные возможности органической химии дополняются не менее широкими возможностями микробиологической, или ферментативной, химии. Методы химии и микробиологии, конкурируя между собой, дополняют друг друга. В различных случаях предпочтение отдается тому или другому подходу на основе сравнительной оценки их рентабельности, особенностей технологии, влияния производственных процессов на человека и биосферу в целом.

Преимущества ферментативных методов по сравнению с химическими заключаются в следующем:

1) специфичность действия ферментов позволяет осуществлять весьма тонкие перестройки молекул разных соединений с использованием простых технологических схем, в то время как аналогичные химические превращения обычно требуют трудоемких многостадийных синтезов или вообще невозможны:

2) «мягкие» условия действия ферментов, так как они функционируют обычно в водных, неагрессивных средах и при температуре не выше 100 °С;

3) небольшое количество вредных для биосферы отходов и побочных продуктов.

Последние две особенности характеризуют микробиологические методы как основу «мягкой технологии» в отличие от химических, которые по технологическим условиям и действию на биосферу являются «жесткими».

Недостатками микробиологических методов на современном уровне их развития по сравнению с химическими являются следующие. Ферменты функционируют в большинстве случаев в водной среде, а большинство субстратов как правило плохо растворимы в воде. Поэтому в процессах приходится использовать растворы низкой концентрации, что приводит к низкому выходу целевого продукта с единицы объема аппарата. В связи с этим, а также некоторыми другими трудностями, связанными с культивированием микроорганизмов (необходимость асептических условий, интенсивного массообмена и обработки больших количеств микробной массы или культуральной среды, загрязнением целевого продукта биотрансформации питательными веществами и продуктами их метаболизма и др.), крупнотоннажное производство на основе методов микробиологи-ческой трансформации требует высоких энергетических затрат.

Поэтому на современном этапе методы микробной химии рентабельны, прежде всего, в тех случаях, когда необходимы тонкие перестройки достаточно сложных молекул, таких, как углеводы, стерины и стероиды, антибиотики, алкалоиды, простагландины, некоторые аминокислоты, нуклеотиды и др., если речь идет о производстве средних масштабов — не более чем сотен или тысяч тонн в год.

13. Известно, что растения Digitalis lanata можно синтезировать как токсичный дигитоксин, так и менее токсичный дигоксин. Возможно ли преобразование дигитоксина в дигоксин с помощью биотехнологии

Важнейший источник стероидных гормонов - культуры клеток растений. Такое культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов.

Биотрансформация стероидов с использованием культур растительных клеток имеет целый ряд преимуществ перед микробиологической трансформацией. Так, если трансформация в положения 3 и 5 характерна практически для всех используемых культур (микроорганизмы, растительные клетки), то реакции Iβ -, 4β -, I2β - (дигитоксин в дигоксин), 16β -гидроксилирования и изомеризации 17β -лактонного кольца, осуществляются только некоторыми культурами растительных клеток, и сильно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации. Это можно обьяснить тем, что бактерии и грибы не являются продуцентами стероидов, а значит, для их ферментных систем стероиды являются незнакомыми субстратами.

Изучение биотрансформации малоиспользуемого в терапии сердечного гликозида дигитоксина в ценные гликозиды (дигоксин, пурпуреогликозид А и др.) проводилось на клеточных линиях Digitalis. Высокий выход конечных продуктов был достигнут при селекции специализированных линий и оптимизации условий роста в специальных аппаратах.

Процесс биотрансформации дигитоксина протекал в две стадии. После 10-дневной инкубации клеток Digitalis lanata в “ростовой” питательной среде культуру переносили в " продукционную” среду (8% раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации- дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в дигоксин.

Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток, использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений.

14. Проанализируйте возможность успешного сочетания процессов биосинтеза, оргсинтеза и биотрансформации на примере получения беталактамных антибиотиков?

Беталактамные антибиотики – пенициллины и цефалоспорины. Полусинтетические беталактамные антибиотики получают химической или биохимической трансформацией) природных пенициллинов и цефалоспоринов (пенициллин G, цефалоспорины С и N), которые в результате ферментативного или химического гидролиза переводят в 6-аминопеницилановую и 7-аминоцефалоспорановую кислоты. Далее проводят реакцию ацилирования аминогрупп в 6-АПК и 7- АЦК остатками кислот, отличных от тех, которые присутствуют в природных антибиотиках. Полученные антибиотики обладают более высокой эффективностью и устойчивостью к действию бетта-лактамаз.

15. Для решения проблем рентабельности производства, его экологичности, управляемости производственным процессом, повышения качества получаемых лекарственных средств используют иммобилизацию микроорганизмов и растительных клеток. Укажите преимущества этого метода по сравнению с использованием неиммобилизованных клеток, на примере получения гормональных препаратов стероидной структуры?

Иммобилизованными называют клетки, которые лишены подвижности за счет прикрепления к частицам нерастворимого носителя или к каким либо поверхностям. Такие биокатализаторы имеют целый ряд преимуществ перед свободными клетками. Во-первых, после окончания процесса культивирования, при выделении целевого продукта свободные клетки, как правило, погибают. Из-за малых размеров их невозможно отделить и сохранив стерильность использовать в следующем производственном цикле. Иммобилизованные на крупных частицах носителя клетки легко отделить фильтрованием, промыть и их использовать много раз. Во вторых использование иммобилизованных клеток значительно упрощает конструкцию ферментера (в простейшем виде – проточная колонна наполненная гранулами носителя с иммобилизованными на них клетками) и позволяет проводить процессы в непрерывном режиме.

В настоящее время все основные энзиматические процессы, используемые в стероидной химии, осуществлены с помощью иммобилизованных клеток: 1.2-дегидрирование, 11-- и 11--гидрокси-лирование, стереоспецифическое 17--восстановление, 20-- и 20--восстановление, дезацетилированние, трансформация стеринов и некоторые другие. Острая необходимость применения для трансформации иммобилизованных клеток обусловлена тем, что стереотрансформирующие ферменты, особенно гидролазы и гидрогеназы, являются весьма лабильными, их выделение и очистка затруднены. Иммобилизованные клетки могут служить в этих случаях " носителем" активных и стабильных полиферментных систем, регенерирующих необходимые им кофакторы.

16. Известно, что требования экологии часто не совпадают с технологическим регламентом фармацевтического производства в целом и биотехнологического в частности. Какие виды очистки, и для какого рода отходов предусматривают использование «активного ила» иискусственно созданых «штаммов-деструкторов»?

Активный ил — биоценоз зоогенных скоплений (колоний) бактерий и простейших организмов, которые участвуют в очистке сточных вод. Применяется в биологической очистке, прежде всего бытовых сточных вод. Данный метод был изобретён в Великобритании в 1913 году. 1" Биологическая очистка сточных вод осуществляется с целью удаления из них органических веществ, в том числе соединений азота и фосфора.

Метод биологической очистки основан на способности некоторых видов микроорганизмов в определённых условиях использовать загрязняющие вещества в качестве своего питания. Множество микроорганизмов, составляющих активный ил биологического очистного сооружения, находясь в сточной жидкости, поглощает загрязняющие вещества внутрь клетки, где они под воздействием ферментов подвергаются биохимическим превращениям. При этом органические и некоторые виды неорганических загрязняющих веществ используются бактериальной клеткой в двух направлениях:

1.Биологическое окисление в присутствии кислорода до безвредных продуктов углекислого газа и воды:

Органическое вещество + О2 (в присутствии ферментов) => СО2 + Н2О + Q Выделяющаяся при этом энергия используется клеткой для обеспечения своей жизнедеятельности (движение, дыхание, размножение и т. п.).

2.Синтез новой клетки (размножение):

Органическое вещество + N + P + Q (в присутствии ферментов) => НОВАЯ КЛЕТКА

Интенсивность и глубина протекания процессов зависит от качественного состава активного ила, разнообразия форм и видов микроорганизмов, способности их адаптации (приспособления) к конкретному составу загрязняющих веществ сточной жидкости и условий проведения процесса.

Биологическая очистка осуществляется в несколько стадий:

1. анаэробная стадия;

2. аэробная стадия;

3. отстаивание в промежуточном отстойнике;

4. глубокая биологическая доочистка с применением иммобилизованных на носителе микроорганизмов;

5. разделение водно-иловой смеси в окончательном отстойнике;

6. обезвоживание илового осадка;

7. сушка илового осадка.

Однако метод биологической очистки с помощью активного ила малоэффективен для нейтрализации отходов неприродного происхождения (отходы химических, фармацевтических производств), т.к. для микробных ферментов эти вещества являются “незнакомыми”. Для очистки сточных вод от таких веществ используют специально сконструированные методом генной инженерии штаммы-деструкторы, сочетающие в себе способности нескольких разных микроорганизмов трансформировать отдельные фрагменты неприродной молекулы.

17. В биотехнологии существует метод создания новых антибиотических препаратов с использованием мутасинтеза. В чем состоит суть метода и его основные возможности?

Одним из способов получения антибиотиков (мутасинтез) состоит в использовании для их биосинтеза так называемых “блокированных” мутантов, у которых в результате мутации изначально отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Такие блокированные мутанты не способны образовывать молекулу антибиотика целиком. Получение таких мутантов осуществляется обычно методами генной инженерии путем целенаправленного удаления определенных генов. Сущность метода состоит в том, что в питательную среду, где осуществляется культивирование таких блок-мутантов, в идиофазе вводят различные мутасинтоны D* (вещества близкие по структуре соединению D, синтез которого блокирован). Поскольку для ферментов вторичного метаболизма характерна низкая субстратная специфичность, то эти аналоги блокированного предшественника антибиотика могут быть трансформированы ферментной системой клеток блок-мутантов в аналоги самого антибиотика – вещества E*. Этот процесс носит название мутационный биосинтез, или мутасинтез:

Подходящие мутасинтоны могут быть получены методами химического синтеза или биосинтеза.

Большой интерес как исходные вещества (синтоны, билдинг-блоки, темплейты, шаблоны) для синтеза различных модификаций природного антибиотика представляют и продукты его неполного синтеза В. Используя методы биотрансформации и химического синтеза в такие молекулыможно вводить разнообразные фрагменты, отличные от того, который имелся в природной молекуле.

Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способность к алкилированию, образуют аналог предшественника рифамицина β - рифамицин SV, содержащий свободную незамещенную гидроксильную группу, который служит исходным веществом для получения многих син-тетических рифамицинов (препараты для лечения туберкулеза и проказы).

рифамицин В рифамицин SV рифамицин L

Иногда активностью могут обладать и сами продукты неполного синтеза некоторых антибиотиков (получение различных производных эритромицина).

18. Что представляет собой биоизостерическая замена? Как этот прием используется при создании новых лекарственных препаратов.

Биоизостерическая замена — это замена функциональной группы в исходной молекуле на другую, внешне не похожую, при которой сохраняется или усиливается биологическая активность молекулы. Для этого исходная и замененная группы должны иметь примерно одинаковое пространственное строение и распределение зарядов по атомам, входящим в группу. Этот прием широко используется при создании новых лекарств и ядохимикатов. С помощью биоизостерической замены исследователям удаётся, например, уменьшить токсичность активного соединения, повысить его растворимость и устойчивость к действию ферментативных систем организма и т. д. Например, в лекарственных препаратах крайне нежелательно наличие свободной карбоксильной группы, т. к. в этом случае возможно образование нерастворимых кальциевых солей. Поэтому карбоксильную группу заменяют на тетразольную. Фрагмент N-H этой группы является аналогом фрагмента О-Н в карбоксильной группе и, с одной стороны обеспечивает кислотные свойства молекулы, а с другой, тетразольная группа не образует солей с ионами кальция.

19. Получение субстанции аскорбиновой кислоты является многостадийным процессом, в котором сочетаются методы органического и микробиологического синтеза. Какой предшественник аскорбиновой кислоты получают использованием биотехнологии и каково значение этого этапа для всего процесса в целом?

Основным способом промышленного производства аскорбиновой кислоты является метод Рейхштейна. Производство аскорбиновой кислоты – многостадийный трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую и несколько химических стадий. Исходным субстратом по этому способу – является D-глюкоза. Метод нашел применение во многих странах, в т. ч. СССР и России.

Метод Рейхштейна состоит из 6 стадий, включая 1 стадию микробного синтеза:

1 стадия. Получение D-сорбитола из D-глюкозы методом каталитического восстановления водородом.