Последовательность операций при установлении первичной структуры белка

Белок

Раскрытие дисульфидных мостиков окислением белка надмуравьиной кислотой

Денатурированный белок

Селективный гидролиз в присутствии ферментов или избирательная деструкция химических методов

Смесь пептидов

Фракционирование методом высоковольтного электрофореза

Основные Нейтральные Кислые

пептиды пептиды пептиды

Субфракционирование методами электрофореза и хроматографии

Индивидуальные пептиды

Определение последовательности аминокислотных остатков в каждом пептиде

Первичная структура двух полных наборов

индивидуальных пептидов

Воссоздание первичной структуры белка

Первичная структура белка

На рисунке 2 приведены массовые числа, соответствующие аминокислотному типу фрагментации пептида, аминогруппа N-концевой аминокислоты – лейцина ацилирована и имеет деканоильную группировку, карбоксильная группа С - концевой аминокислоты – аланина, этерифицирована и несет метильную группу. Фрагментация идет по аминокислотному типу, т.е. преимущественно по пептидным связям с образованием фрагментов, характеризующихся соответствующими массовыми числами.

По методу Эдмана используется фенилизотиоцианат. Метод позволяет последовательно отщепить N-концевые аминокислоты в виде фенилтиогидантоионов, которые поглощают свет в УФ-области при 265-270 нм. Идентификацию фенилтиогидантоионов осуществляют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), жидкостной хроматографии высокого разрешения, а также масс-спектроскопии.

Рис.2. Масс-спектр метилового эфира N-деканоиллейцилаланил-аланилаланина.

Среди ферментативных методов расщепления полипептидной цепи на фрагменты широко используют трипсин, который гидролизирует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот (R–СН-СООН) – лизина, аргинина. Химотрипсин гидролизирует ароматические аминокислоты – тирозин, фенилаланин, триптофан.

Для исследования пространственной структуры (конформации) белков используется рентгеноструктурный кристаллографический анализ. Метод основан на дифракции рентгеновских лучей электронами, окружающими ядра атомов в кристалле белка (рис.3).