Технологии генетического конструирования организмов

Получение рекомбинантного инсулина. Гормон инсулин построен из двух полипептидных цепей, А и Б, длиной в 20 и 30 аминокислот соответственно. Последовательность цепей была установлена в 1955 году Сэнгером. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 году был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным. Получали инсулин до 1980 году за счет выделения его из поджелудочной железы (поджелудочная железа коровы весит 200–250 г, а для получения 100 г кристаллического инсулина требуется до 1 кг исходного сырья). Поэтому потребности в нем удовлетворяли не полностью. Так, в 1979 году из 6 млн. зарегистрированных больных сахарным диабетом инсулин получали только 4 млн. человек. В 1980 году датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты.

В организме животного две полипептидные цепи исходно являются частями одной белковой молекулы длиной в 109 аминокислот – это препроинсулин. При синтезе в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для транспорта молекулы сквозь мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются, и образуется проинсулин длиной в 86 аминокислот.

В 1980 году Гилберт с коллегами выделили мРНК инсулина из опухоли β -клеток поджелудочной железы крысы. Полученную ДНК-копию мРНК встроили в плазмиду pBR 322, в среднюю часть гена пенициллиназы (фермент в норме выделяется из клетки), которую транспортировали в бактерию. Сконструированная плазмида, как оказалось, содержала информацию о структуре проинсулина, а не препроинсулина. При трансляции мРНК в клетках E. coli синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Гормон из этого белка выщепляли трипсином. Было доказано, что полученный таким образом белок влияет на сахарный обмен аналогично гормону поджелудочной железы. В 1979 году в США в течение трех месяцев синтезировали гены, кодирующие А- и В-цепи инсулина; гены были собраны из 18 и 11 олигонуклеотидов соответственно. Далее гены были встроены, как и при получении соматостатина, в плазмиду в конце гена β -галактозидазы кишечной палочки.

В клетках E. coli также осуществлен синтез проинсулина, а не только его отдельных цепей. На выделенной матричной мРНК синтезировали ДНКкопию. Синтез проинсулина имеет определенные преимущества, так как процедуры экстракции и очистки гормона минимальны.

Совершенствование техники получения генноинженерных штаммовпродуцентов с помощью различных приемов (амплификацией плазмид, инкапсулированием вводимых рекомбинантных ДНК, подавлением протеолитической активности реципиентных клеток) позволило получить высокие выходы гормона, до 200 мг/л культуры. Медико-биологические и клинические испытания генноинженерного белка показали пригодность препарата, и в 1982 году он был допущен к производству во многих странах.

Лекция