Руководство преподавателя

Этот протокол симулирует диагностический тест на наличие определенных антител в сыворотке крови. Ученикам даются образцы (предполагается, что это образцы сыворотки крови) и они с помощью ИФА определяют присутствие в них антител (антител к каким-то возбудителям болезней, сигнализирующим о заражении этой болезнью). Вы можете придумать любую болезнь, которая будет интересна вам и ученикам (ВИЧ, атипичная пневмония, трихинеллез, туберкулез, клещевой энцефалит и др.). Такой метод диагностики используется, когда антиген по какой-то причине не детектируется с помощью ИФА, но организм уже начал вырабатывать антитела и их можно обнаружить. Например, до недавнего времени, ВИЧ можно было диагностировать только с помощью такого теста. Сейчас, благодаря большим усилиям и вложениям средств в исследования по ВИЧ, стало возможно непосредственно определять антиген ВИЧ в крови с помощью ИФА, что позволяет обнаружить вирус на более ранней стадии, быстрее начать лечение и продлить жизнь больным.

Чтобы лучше подготовиться к урокам и придумать интересный контекст для работы, прочитайте это руководство и приложения А, Б и В.

План уроков

Общий план работы

Шаг 1: с помощью микропипетки 50 мкл раствора очищенного антигена к исследуемым антителам, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

Шаг 2: в лунки добавляется 50 мкл исследуемого «образца сыворотки» (раствора, которые может содержать первичные антитела), а также положительный и отрицательный контроли (растворы, заведомо содержащие и не содержащие первичные антитела) и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела (например, человеческие антитела, если вы симулируете диагностику определенной болезни) и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовали первичные антитела к антигену («положительный дианоз»), то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антител в образце не было, раствор останется бесцветным.