ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме

Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (адаптерами) (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны (IRAP - Inter-retransposon amplified polymorphism).

RAPD-маркеры. К этой группе относятся маркеры, основанные на ПЦР с применением праймеров с произвольной, случайной последовательностью. Для синтеза таких праймеров нет необходимости в знании конкретных нуклеотидных последовательностей генома исследуемого организма. Праймеры с произвольной последовательностью должны лишь отвечать определённым требованиям по соотношению GC-пар (около 60%) и длине. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR). Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого праймера с низкой температурой отжига в реакции ПЦР. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении амплифицированных продуктов образуются дискретные продукты, размер которых варьирует от 100 до 5000 п.н. (ДНК-паттерны). Эти фрагменты представляют собой анонимную, как правило, уникальную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами. Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру). Большинство RAPD-маркеров являются доминантными (наличие/отсутствие полосы в ДНК-паттерне).
Несколько позже были предложены другие сходные технологии: DAF (DNA Amplified Fingerprinting) и УП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами). Все описанные методики различаются размерами праймеров (10-12 нуклеотидов в случае RAPD, около 20 нуклеотидов в случае AP-PCR, 7-8 нуклеотидов в случае DAF и 25-27 нуклеотидов в случае УП-ПЦР), их составом (от 50 до 80% ГЦ-пар), температурой отжига и методами выявления продуктов реакции (окрашивание бромистым этидием, радиоавтография, серебрение).
RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР показана видоспецифичность ДНК-паттернов. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, cельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков. Показаны ассоциации некоторых RAPD-маркеров с генами резистентности к различным болезням у растений.

К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма и как источник уникальных локус-специфичных маркеров.

Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученного сиквенса подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры названы SCAR-маркерами (Sequence Characterized Amplified Region). Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта.

Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры)

Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования, в популяционных и филогенетических исследованиях. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп.

ISSR. Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый " якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями (как правило, это уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны. ISSR-маркеры также относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Аналогично RAPD и AFLP для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и наряду с AFLP может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования. ISSR-маркеры могут быть использованы также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков.