Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания – простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацетоорсеином или ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания. Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК – белок в разных участках по длине хромосом. Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо.

Способы дифференциального окрашивания: Q, G, R, C, T - окрашивание.

а) Q – сегменты (quinacrine, акрихин) – участки хромосом способных связывать флюорохромы, флюоресцирующие (яркое свечение) после окрашивания акрихин – ипритом. Q – сегменты соответствуют участкам богатым АТ парам (55 – 65%) ДНК и содержат тканеспецифические гены, реплицирующиеся во второй половине S – периода интерфазы. Преимущество Q метода состоит в том, что позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать «У» хромосому человека по яркой флуоресценции в виде парных светящихся точек. Для просмотра таких препаратов используют люминесцентный микроскоп.

б) G – сегменты (Gitmsa, Гимза) выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными протеолитическими процедурами, которые способствуют тому, что краситель адсорбируется наиболее интенсивно на определённых G – сегментах (образуя тёмные диски - гетерохроматиновые участки и светлые - эухроматиновые). Этот метод чаще используют в повседневной работе большинства лабораторий, поскольку он не требует использование флуоресцентного микроскопа. Q и G сегменты совпадают. К разновидностям окрашивания по методу Гимзы относятся R и С – окрашиваемость

в) R – сегменты (reverse, обратные) окрашиваются после тепловой денатурации и располагаются между Q и G сегментами. Окрашенные и неокрашенные сегменты располагаются обратно тому, что наблюдается при G и Q – окрашивании. R – сегменты, соответствуют участкам богатым ГЦ – парам (50 – 60%) ДНК, которые более устойчивы к тепловой денатурации. Они содержат общеклеточные гены, реплицирующиеся в первой половине S – периода интерфазы (на G и Q окрашенных хромосомах это светлые – эухроматиновые участки). На R – окрашенных хромосомах это тёмные эухроматиновые. Гетерохроматиновые и околоцентромерные районы остаются светлыми

г) С– сегменты (constituve heterochromatin, конститутивный гетерохроматин) окрашивают прицентромерные районы хромосом, более устойчивые к химическим и физическим повреждениям. В этих участках ДНК с многократно повторяющимися последовательностями. С – окрашивание позволяет выявить сегменты центромерных участков коротких плеч 13, 14, 15, 21, 22, и У хромосом. Это окрашивание выявляет, структурный, или конститутивный гетерохроматин.

д) Т – сегменты, окрашивание теломерных концевых зон хромосом.

Достижения молекулярной цитогенетики позволили внедрить в клиническую цитогенетику новых технологий, таких как ДНК диагностика, гибридизация нуклеиновых кислот на препарате in siti, а также компьютерных систем для анализа хромосом. ДНК диагностика основана на использовании технологии рекомбинантных молекул ДНК для выявления молекулярно генетического дефекта хромосом. Флуоресцентная гибридизация на препарате in siti FISH - Fluorescent In Situ Hybrization включает применение специально подготовленных (флюоресцирующих) ДНК проб. ДНК – зонды представляют собой клонированные фрагменты генома человека для выявления генетических дефектов на хромосомном уровне. При этом используется многоцветовая флуоресцентная

in siti гибридизация ДНК на препарате метафазных хромосом или интерфазных клеток для маркировки хромосом или их участков. Данная диагностика, охватывает практически весь спектр хромосомных аномалий, что в первую очередь позволяет выделять редкие хромосомные синдромы. Метод FISH может применяться и для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах.