Цель: Ознакомление с хроматографическими методами исследования качества продовольственных товаров

Хроматографические методы широко применяют при проведении исследований, не выполнимые другими инструментальными методами. Хроматографию как метод разделения впервые открыл в 1903 г. русский ученый М. С. Цвет, применив принцип адсорбции для анализа хлорофилла. В настоящее время хроматография охватывает различные методы разделения.

Хроматографические методы классифицируют в соответствии с выбранным типом подвижной и неподвижной фаз. В зависимости от агрегатного состояния фаз различают твердо-жидкостную (ТЖХ), жидко-жидкостную (ЖЖХ), газоадсорбиционную (ГАХ), газожидкостную (ГЖХ) хроматографию, а в зависимости от природы механизма разделения – распределительную, адсорбционную, ионообменную и др.

В распределительной хроматографии вещества распределяются между двумя жидкими фазами, одна из которых неподвижная.

Адсорбционная хроматография основана на сорбции растворенного вещества поверхностью твердой фазы,

ионообменная – на образовании ионных Соединений между растворенными веществами и заряженными группами сорбента.

По виду вспомогательных средств различают тонкослойную, бумажную, газовую, газожидкостную и колоночную хроматографию.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография – очень удобный метод разделения небольших количеств многокомпонентных смесей веществ. Преимущества этого метода перед бумажной хроматографией: быстрота разделения веществ, устойчивость слоя к агрессивным проявителям и нагреванию и часто значительно большая чувствительность, чем на бумаге, что позволяет обнаружить в случае применения некоторых реагентов ничтожно малые количества разделяемых веществ (от 0, 1 до 0, 005 мкг).

При использовании тонкослойной хроматографии для ко­личественного определения применяют тонкий слой силикагеля, нанесенный на стандартные стеклянные пластинки; для осуществления качественного анализа веществ – слайды (слой силикагеля, нанесенный на предметное стекло), а также силуфольные пластинки, содержащие флуоресцентный индикатор.

В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии.

Для разделения веществ методом тонкослойной хроматографии применяют как одномерную, так и двумерную хроматографию.

Для тонкослойной хроматографии необходим сорбент, который не содержит примесей тяжелых металлов и органических веществ. Примеси железа, присутствуя, в частности, в силикагеле, катализируют окисление жирных кислот, вызывают изомеризацию органических соединений.

Силикагель, применяемый в тонкослойной хроматографии, должен иметь крупнопористое строение, размер зерна – 150-200 меш (размер отверстия сита – соответственно 0, 10-0, 07 мм). Для тонкослойной хроматографии чаще всего используют готовый силикагель.

За рубежом некоторые фирмы («Дезага», «Гейдельберг», «Мерк», «Дармштадт» и др.) готовят специально силикагель G, кизельгур С и окись алюминия Gс добавкой 5 % гипса и без добавки его.

Чтобы получить закрепленный слой, сорбент закрепляют на стеклянной пластине фиксатором: гипсом медицинским, штукатурным, рисовым или маисовым крахмалом.

Пластинки с закрепленным слоем сорбента готовят следующим образом: на воздухе при комнатной температуре в течение 15-20 мин на горизонтальной поверхности моют и сушат стеклянные пластинки подходящего размера (20X15, 20Х10, 20x20 см), устанавливают прибор для нанесения слоя, готовят сорбционную массу в виде суспензии из сорбента, фиксатора и воды и аппликатором разравнивают ее по поверхно­сти стеклянных пластинок. После сушки пластинки активизи­руют нагреванием в сушильном шкафу или выдерживанием на воздухе.

Для пяти пластинок размером 20X20 см с толщиной слоя сорбента 250 мкм берут 25-30 г силикагеля, содержащего 5 % гипса, смешивают в ступке с 35 мл воды, Затем к полу­ченной пасте при перемешивании добавляют еще 15 мл воды. Суммарная продолжительность перемешивания не должна пре­вышать 100 с.

Полученную суспензию выливают в аппликатор, посред­ством которого ее переносят на пластинку.

Суспензию можно приготовить и другим способом. Берут 25 г сорбента, прибавляют 50 мл дистиллированной воды, все тщательно перемешивают в колбе с пробкой и выливают в аппликатор. Чтобы устранить побочный эффект, пластинки освобождают от сорбента по периметру на 5-7 мм.

Готовые пластинки хранят в эксикаторе, содержащем влагопоглотитель: силикагель, H₂SO₄, СаС1₂.

Пробы испытуемых веществ (от 5 до 1000 мкг) наносят на расстоянии 1, 5 см от нижнего края пластинки сплошной по­лосой (капля к капле) или каплей. Для нанесения пробы при­меняют микропипетки или откалиброванные микрошприцы. При этом слой сорбента не должен нарушаться.

Ниже рассмотрено разделение веществ методом восходя­щей хроматографии в закрепленном слое. Камера для хроматографирования на закрепленном слое сорбента представляет собой подходящий по размеру пластинки стеклянный сосуд любой формы с плоским дном. Высота камеры должна быть примерно 25 см при размере пластинки 20X20 см.

В сосуд наливают растворитель или систему растворителей в таком количестве, чтобы поставленная вертикально пла­стинка с нанесенным веществом погружалась в растворитель на 5 мм ниже вещества, нанесенного для разделения.

Для насыщения камеры парами растворителей к задней стенке ее прикрепляют смоченный растворителем лист филь­тровальной бумаги, достигающий дна сосуда. Сверху камеру закрывают пришлифованной крышкой или стеклом. Высота подъема жидкости по слою сорбента не должна превышать 10-11 см, так как при большем пробеге растворителя наблю­даются сильное замедление продвижения жидкости и диффу­зия пятен.

После того, как жидкость поднимется на указанную вы­соту, пластинку вынимают и отмечают линию фронта, а также высоту подъема растворителя. Затем пластинку сушат в вы­тяжном шкафу в токе воздуха.Для разделения веществ обычно растворитель пропускают по пластинке с сорбентом один раз. Если в одной системе растворителей не все вещества смеси разделяются одинаково хорошо, то применяют так называемое ступенчатое, или по­вторное, хроматографирование в разных системах раствори­телей.

Сначала применяют систему, которая делит менее поляр­ные вещества. При этом растворитель продвигается вперед почти до конца пластинки. Затем хроматограмму сушат для удаления растворителя, и хроматографирование проводят в другой системе растворителей, которую пропускают на бо­лее короткое расстояние, чем первую.

Чтобы обнаружить вещества, поглощающие ультрафиоле­товые лучи в определенной области спектра, часто применяют слои сорбента, содержащие флуоресцирующее вещество, либо опрыскивают хроматограмму раствором флуоресцирующего вещества или веществ, поглощающих ультрафиолетовые лучи в определенной области спектра, или пользуются источниками света с максимумами излучения в области 254 и 365 нм. Для этого применяют следующие приборы: ультрахимескоп, даю­щий максимум излучения в области 254 нм, и настольный ультрафиолетовый осветитель с максимальным излучением около 365 нм.

Если оптическими методами нельзя обнаружить вещества на хроматограммах, то применяют химические методы про­явления.

Для проявления парами йода пластинку помещают в экси­катор с кристаллами йода в разогретой фарфоровой чашке. Через 10-15 мин пластинку вынимают и оставляют на воз­духе до испарения избытка йода. При этом на светлом фоне образуются окрашенные пятна веществ.

Метод рекомендуется для определения непредельных и других соединений. Для проявления отдельных пятен наибо­лее широко применяют опрыскивание пластинки реактивами, дающими цветные реакции с разделенными веществами. Оп­рыскивание проводят в стеклянном колпаке.

При идентификации веществ определяют пробег исследуе­мого вещества (фракции) от линии старта. Это определение не является достаточным, так как R_fхарактеризует лишь от­носительное положение пятна внутри хроматограммы.

Для точного указания условий анализа пользуются вели­чиной R_st, определяемой как отношение расстояния исследу­емого вещества от старта к расстояний пятна от старта.

Количество вещества в пятне определяют по площади его поверхности, которая зависит от количества нанесенного ве­щества, толщины и активности слоя, а также объема нанесен­ного раствора.

Пробы анализируемых веществ на одной пластинке сравни­вают с пробой эталонных образцов на другой. Для этого изме­ряют площади пятен. На основании количества взятого веще­ства и найденной площади строят калибровочную кривую.

Для количественного определения разделенных веществ применяют также фотометрические методы.

Анализ природных липидов. Методом восходящей хромато­графии в закрепленном слое можно получить общее представ­ление о составе исследуемой смеси липидов. Этим методом липиды и продукты гидролиза хорошо разделяются на отдель­ные классы соединений. Перед разделением липидов из продуктов животного происхождения их извлекают методом экстрак­ции, соблюдая следующие основные правила:

все операции (гомогенизацию, экстракцию и др.) прово­дить в атмосфере азота, чтобы избежать автоокисления нена­сыщенных липидов. Для этого можно применять аппарат Сокслета или экстрактор и использовать только очищенный и свежеприготовленный растворитель;

придерживаться соотношения массы, полученной при из­мельчении продукта, и экстрагирующего раствора (не менее 1: 25);

нагревать растворы, содержащие липиды, только в случае крайней необходимости;

удалять из липидных экстрактов все нелипидные составные части без потерь липидов;

хранить экстрагированный материал в условиях, обеспечивающих минимальное изменение липида: в петролейном эфире, хлороформе, в атмосфере азота, в холодильнике, в запаянных ампулах.

В зависимости от фракционируемого класса липидов применяют следующие растворители в соотношении по объему: жирные кислоты – растворители; ледяная уксусная кислота – вода (24: 1); жирные кислоты и их метиловые эфиры – растворители: ледяная уксусная кислота – вода (3: 1); холестериновые эфиры высших жирных кислот – растворители: метилэтилкетон – ацетонитрил (7: 3); диглицериды – растворители: хлороформ – метанол – вода (5: 15: 1).

Для разделения липидов на закрепленном силикагеле применяют растворители в различных соотношениях: петролейный эфир-диэтиловый эфир в соотношении 80: 20 по объему – для альдегидов и моноглицеридов; петролейный эфир – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота (80: 20: 1) – для смеси липидов, содержащих свободные жирные кислоты; гексан – эфир – уксусная кислота (90: 10: 1) – для нейтральных липидов; хлороформ – метанол – вода (65: 25: 4) – для фосфолипидов.

При изучении фосфолипидных фракций, входящих в состав желтка куриных яиц, используют адсорбционную хроматографию в тонком (0, 5 мм) незакрепленном слое силикагеля КСК отечественного производства. Размолотый, отмученный и очищенный от посторонних примесей силикагель с частицами размером 30-50 мкм (200 меш) наносят посредством аппликатора и специального устройства на стеклянную пластинку размером 10X20 см.

Перед использованием готовой пластинки нанесенный слой промывают метанолом, чтобы освободить рабочий слой силикагеля от возможных органических примесей.

Для разделения фосфолипидов непосредственному фракцио­нированию подвергают общие липиды, растворенные в хлороформе, которые в количестве 30 мкг наносят по фосфору тонкой полоской длиной 5 см на пластинку.

Чтобы получить отдельные фракции фосфолипидов, липиды разгоняют в нейтральной системе хлороформ – метанол – вода (65: 25: 4). Для этого используют высокие стеклянные камеры с пришлифованными крышками, которые устанавливают на строго горизонтальную поверхность.

Чтобы выявить расположение отдельных фракций фосфолипидов, пластинки после просушивания под тягой помещают в эксикатор с парами йода либо опрыскивают 0, 04 %-ным спиртовым раствором 2, 7-дихлорфлюоросцеина и просматривают в ультрафиолетовом свете. В первом случае на пластинках в местах расположения фосфолипидов на белом фоне видны желто-коричневые полосы, во втором – на светло-сером фоне наблюдается желтое и фиолетовое свечение.

Расположение отдельных фракций фосфолипидов на тонком слое силикагеля от линии старта следующее: лизолецитины, сфингомиелины, серинфосфатиды, лецитины (холинфосфатиды), этаноламинфосфатиды, цереброзиды, прочие липиды.

Фосфолипиды идентифицируют по тестам – цветным реакциям. Для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминогруппы (этаноламинфосфатиды и серинфосфатиды), пластинки обрабатывают нингидрином и наблюдают красное окрашивание пятен на белом фоне.

Холинсодержащие фосфолипиды (лецитины, лизолецитины, сфингомиелины) обнаруживают опрыскиванием пластинок реактивом Драгендорфа (1, 7 г Bi(NO₃)₂· 5Н₂O в 20 %-ной уксусной кислоте +10 %-ный водный раствор KJ). В этом случае на пластинке появляются желто-оранжевые пятна на бледно-желтом фоне. Цереброзиды обнаруживают путем обработки хроматограммы раствором молибденовокислого аммония в смеси с соляной и хлорной кислотами

3 г(NH₄)₂МО₄ + 25 мл Н₂O+3мл НСl+15 мл 60%-ной НСlO₄.

После нагревания пластин в течение 20 мин в сушильном шкафу при 110 °С пятно цереброзидов приобретает фиолетовую окраску, остальные пятна фосфолипидов – коричневую.

Для количественного определения отдельных липидных фракций отдельные пятна соскабливают с пластинки и переносят в пробирку объемом 20 мл, заливают три раза по 10 мл метанолом, взмучивают и настаивают каждый раз по 5 мин. Затем для лучшей очистки от силикагеля элюаты центрифугируют при частоте вращения 6000 об/мин и декантируют в мерные цилиндры со шлифом. Часть элюата (например, половину объема) используют для количественного определения фосфо-липидов.

О содержании определенного фосфолипида в липидах животной ткани судят по молярному содержанию фосфора в элюате. Для этого элюаты минерализуют в присутствии молибденовокислого аммония и аскорбиновой кислоты.

Окрашенные растворы фосфора после инкубирования коло-риметрируют на спектрофотометре (λ = 820 нм).

Для построений калибровочной кривой, необходимой при определении фосфора в элюате лецитина из пятна, применяют однозамещенный фосфорнокислый калий КН₂РО₄.

Анализ карбонильных соединений. Алифатические альдегиды и кетоны удобнее разделять в виде их 2, 4-динитрофенилгидразонов (2, 4-ДНФГ). Лучшей системой для разделения н-алифатических альдегидов является тонкий слой силикагеля – крахмал в бензоле, насыщенном водой (98: 8, 2 по объему).

2, 4-динитрофенилгидразона тех же альдегидов, а также циси трансизомеры фурфуриловых альдегидов, бензальдегида и кетонов, глиоксаля и другие соединения идентифицируют на незакрепленном слое окиси алюминия в системе бензол – гексан (1: 1) ив эфире.

Пятна на пластинке обнаруживают фосфорно-молибденовой кислотой.

На слое силикагель – гипс в системе гексан – этилацетат (7: 3 по объему) разделяют коричный и бензойный альдегиды в виде 2, 4-динитрофенилгидразонов в системе бензол – петролейный эфир (3: 1 по объему).

Ряд моно-, ди- и триалкилциклогексанонов с алифатическими и териеновыми заместителями разделяют на закрепленном слое окиси алюминия в системе бензол-петролейный эфир при температуре кипения 40-60 °С (1: 3 по объему). Пятна обнаруживают парами йода или раствором 2, 4-динитрофенил-гидразона.

Анализ углеводов. Для разделения таких гидрофильных со­единений, как углеводы, применяют модифицированные слои: кизельгур – гипс; силикагель – гипс; целлюлоза – гипс.

Смесьcахаров разделяют на слое кизельгур – гипс, пропитанном 0, 02 М раствором ацетата натрия. Разделение Сахаров возможно также на основе силикагель – гипс, пропитанной борной кислотой. Для приготовления слоя к 4 г силикагеля добавляют 6 мл 0, 1 н. раствора борной кислоты. В этом случае хроматографирование ведут в кислых системах.

Системы растворителей для Сахаров: 65 мл этилацетата + 35 мл раствора изопропанол – вода (2: 1); бензол – метанол – уксусная кислота (1: 3: 1); метилэтилкетон – метанол – уксусная кислота (3: 1: 1); этилацетат – пиридин – вода (2: 1: 2); хлороформ – метанол (19: 2, 19: 3, 19: 5).

При количественном анализе Сахаров их элюируют из пятен, выскобленных с пластинки, окисляют 0, 05 н. или 0, 01 и. раствором бихромата калия в 70%-ном растворе серной кислоты. Неиспользованный бихромат подвергают обратному титрованию.

Углеводы разделяют также на слое, приготовленном из водной суспензии порошка целлюлозы М 300. Слой сушат при 100 °С в течение 10 мин. На этом слое моносахариды хорошо разделяются в системе: этилацетат – пиридин – вода (2: 1: 2) при двукратном хроматографировании. Маннозу и арабинозу лучше разделять в системе: фенол, насыщенный водой, с добав­лением 1 %-ного раствора аммиака.

Сахара можно разделять на слое порошка целлюлозы с гипсом. Оптимальное разделение достигается в системах: н-бутанол – 25%-ный аммиак – вода (16: 1: 2) и н-бутанол – пиридин – вода (10: 3: 3). В системе фенол – бутанол – уксус­ная кислота (5: 2: 10) разделяют маннозу, арабинозу и рибозу.

Моно-, ди-, трисахариды разделяют на слоях кизельгур – гипс и силикагель – гипс и на слоях тех же сорбентов, пропитанных 0, 1 %-ным раствором борной кислоты или0, 02 М раствором ацетата натрия.

Хорошо разделяется смесь Сахаров: сахароза, D-мелибиоза, мальтоза, лактоза и раффиноза на основе силикагель – гипс в системе н-пропанол – этилацетат – вода (7: 2: 1 по объему) и в системах: бутанол – ацетон – вода (4: 5: 1); бутанол – уксусная кислота – вода (4: 5: 1 по объему).

Газовая хроматография

Одним из наиболее универсальных хроматографических методов является газовая хроматография, отличающаяся от других хроматографических методов тем, что газ используется как подвижная фаза, а растворенное вещество перемещается по колонке в виде газа или пара, частично растворенного или адсорбированного в неподвижной фазе.

Разделение компонентов смеси основано на различной сорбируемости или растворимости анализируемых компонентов при движении их газообразной смеси вдоль поверхности твердого тела или неподвижной жидкости в колонке.

При прохождении через колонку отдельные компоненты улавливаются (адсорбируются) активным адсорбентом или рас­творяются в пленке неподвижной жидкой фазы, нанесенной на поверхность инертного носителя. В результате неодинаковой сорбируемости или различного взаимодействия с жидкой фазой компоненты смеси продвигаются по колонке с различными скоростями. Движение молекул веществ, обладающих более высокой сорбируемостью в жидкой фазе, замедляется, а неадсорбируемые или нерастворимые компоненты выходят из колонки первыми (рис. 8).Компоненты, вымываемые из колонки, регистрируются детектором, сигналы которого воспроизводятся на самописце в виде пиков. По расположению пиков судят о качественной характеристике веществ сложной смеси, а по площади пиков – о концентрации компонентов в процентах.

Наиболее надежный способ – это идентификация по относительным величинам удерживания (объему V_K^0THили времени

Рис. 8. Схема газового хроматографа:

1 – баллон для газаносителя; 2 – испаритель; 3 – колонка; 4 – детектор; 5 – самописец; 6 – термостат.

Рис. 9. Схема хроматограммы двух компонентов:

а – вещество-свидетель; б – исследуемое вещество.

t_отн), представляющим собой отношение времени (или объема) удерживания данного компонента к соответствующим показателям «стандартного» вещества (рис. 9).

Время, соответствующее периоду от момента ввода пробы до момента появления максимума соответствующего пика, называется временем удерживанияt_K. Времени удерживания соответствует объем удерживания V_K, т. е. объем газа, прошедшего через колонку с момента ввода пробы до момента появления максимума пика.

Концентрация компонентов пропорциональна площади пика, поэтому количественные измерения хроматограмм связаны с определением площадей пиков, соответствующих индивидуальным компонентам.

Площади пика измеряют: планиметрическим методом; умножением высоты пика на его ширину, измеренную на середине высоты; взвешиванием вырезанных из бумаги пиков, интеграторами, непосредственно присоединенными к самописцам так, что площадь измеряется одновременно с записью хроматограммы.

Анализ аминокислот. Аминокислоты – нелетучие или малолетучие соединения. Для определения их состава методом газовой хроматографии необходимо провести гидролиз белка и перевести аминокислоты в летучие соединения.

Гидролиз белков соляной кислотой. Пробу белка, содержащую примерно 1, 6 мг азота, в течение 20 ч кипятят с обратным холодильником с 6 н. раствором соляной кислоты (10 мл). Избыток кислоты удаляют упариванием раствора досуха на паровой бане или при 35 °С и пониженном давлении. Образовавшиесяхлоргидраты аминокислот растворяют в теплой воде, фильтруют, воду отгоняют.

Гидролиз белков гидроокисью бария. Пробу белка, содержащую около 1, 6 мг азота, нагревают с 14 %-ным раствором гидроокиси бария (10 мл) на масляной бане при 125°С. Нагревание с обратным холодильником длится 18-20 ч. Раствор охлаждают и для осаждения бария добавляют избыток нормального раствора серной кислоты. Суспензию фильтруют и остаток промывают горячей водой, содержащей следы уксусной кислоты. Фильтрат концентрируют до небольшого объема при пониженном давлении. Оставшуюся воду удаляют в эксикаторе над хлористым кальцием. В случае необходимости аминокислоты очищают методом ионного обмена.

Приготовление летучих производных аминокислот. Перед разделением аминокислот газохроматографическим методом их переводят в производные, в которых карбоксильная группа, ами­ногруппа или одновременно обе эти группы удалены или защищены другими группами, т. е. их переводят в такие летучие производные, как триметилсилильные(NO-TMC), фенилтиогидантоиновые (ФТГ), N-ацетиловые, н-алкил-трифторацетиловые эфиры (метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый), н-бутил- N-трифторацетильные производные и др.

Разделение аминокислот в виде н-бутил-N-трифторацетиль-ных производных. Аминокислоты этерифицируют н-бутанолом.Из-за плохой растворимости их растворяют в абсолютном метаноле в присутствии сухого хлористого водорода. Затем метанол с хлористым водородом удаляют, а метиловые эфиры аминокислот растворяют в н-бутаноле (переэтерификацию производят в присутствии сухого хлористого водорода).

Полученные бутиловые эфиры подвергают ацетилированию трихлоруксусной кислотой в присутствии хлористого метилена в герметично закрытой трубке при 150° в течение 5 мин.

Эфиры N-ацетилпроизводных разделяют по следующей методике.

В 30 мл абсолютного спирта (этилового, пропилового, бутилового и т. д.) суспендируют 30-15 мг аминокислоты, в реакционную смесь пропускают быстрый ток сухого хлористого водорода до полного растворения осадка. Спирт отгоняют сначала при атмосферном давлении, затем в вакууме при 60-80 °С. Остаток бутилового эфира размешивают с 15 мл уксусного ангидрида, выдерживают 15 мин при комнатной температуре, концентрируют в вакууме при 60°С и растворяют в спирте. Полученный раствор используют непосредственно для хроматографирования.

Бутиловые эфиры разделяют на колонке, заполненной 1 %- ным НПГС (неопентиогликольсукцинат), на газохроме А с размером зерна 60-80 меш. Анализ проводят в изотермическом режиме при температуре колонки 67°С в течение 6 мин и далее в режиме линейного программирования температуры со скоростью 3, 3 °С/мин до 218 °С.

Метиловые эфиры разделяют на колонке, заполненной 2 %- ным НПГС (неподвижная фаза), нанесенной на хромосорбеWс размером зерна 80-100 меш. Анализ проводят сначала в изотермическом режиме при 41 °С в течение 3 мин, затем в режиме линейного программирования температуры со скоростью 3, 3 °С/мин до 218 °С и далее в изотермическом режиме в течение 15 мин.

Газожидкостная хроматография

Для изучения состава жирных кислот, липидов, витаминов, триглицеридов, аминокислот, органических кислот, углеводов, алкалоидов, аромата и других летучих веществ пищевых продуктов наиболее предпочтителен метод газожидкостной хроматографии.

Анализ свободных жирных кислот. Газожидкостная хрома­тография позволяет исследовать самые различные жирные кислоты от С₁ до С₃₀ и выше, насыщенные, разветвленные, ненасыщенные, цис- и трансизомеры, окси-, эпоксикислоты.

Липиды – высокомолекулярные соединения, поэтому для хро-матографического разделения их переводят в метиловые эфиры, а иногда и в этиловые.

Сложные метиловые эфиры имеют более низкие температуры кипения, чем соответствующие им кислоты, и являются менее полярными соединениями.

При анализе метиловых эфиров достигается высокая эффективность разделения при меньших температурах и затратах времени, а полученные данные позволяют с большей достоверностью судить о жирнокислотном составе липидов.

Поглощение свободных жирных кислот из экстракта липидов происходит в динамических условиях на колонке, заполненной смолой амберлит ИРА-401 в бикарбонатной форме.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот.Анализ метиловых эфиров свободных жирных кислот проводят на серийном хроматографе марки JIXM-8 М.Д, мод. 5 или серия «Цвет» с пламенно-ионизационным детектором при следующих условиях разделения: колонка длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм заполнена 15%-нымполиэтиленгликольсукцинатом на цеолите-545 с размером зерна 60-80 меш, скорость газа-носи­теля (азота)–30 мл/мин.

Разделение осуществляется в режиме линейного программи­рования температуры при скорости нагревания 4 °С/мин от 80 до 202 °С и при 202 °С–в изотермическом режиме. Пробу объемом 1-2 мкл вводят в хроматограф микрошприцем на 10 мкл.

Перед анализом метиловых эфиров жирных кислот для их метилирования применяют колоночную хроматографию.

При этом ионообменную смолу готовят следующим образом: 25 г смолы ИРА-401 помещают в коническую плоскодонную колбу объемом 500 мл, заливают 4 н. раствором соляной кислоты и оставляют на 10-12 ч для связывания триметиламина, который образуется при длительном хранении смолы этого типа. Затем смолу промывают сначала несколькими порциями дистил­лированной воды до нейтральной реакции по универсальному индикатору, а затем тремя порциями 96 %-ного этанола для замещения воды и тремя порциями смеси эфира и 96 %-ного этанола (1: 1), после чего в течение 30-40 мин перемешивают с 200 мл нормального раствора бикарбоната натрия.

Хранят смолу в растворе диэтилового эфира или в смеси 96 %-ного этанола с эфиром (1: 1) при 0-2 °С.

Подготовка ионообменной колонки к работе заключается в следующем. В колонку диаметром 10-12 мм и высотой 20-22 см наливают 3-5 мл диэтилового эфира, помещают тампоны из стекловаты и заливают смолу ИРА-401 в бикарбонатной форме, суспендированную в диэтиловом эфире, до получе­ния слоя высотой 15 см. Сверху помещают второй тампон из стекловаты. Смолу промывают 20 мл четыреххлористого углерода и устанавливают скорость истечения из колонки–одна капля в секунду.

По окончании подготовки ионообменной колонки исходный раствор, содержащий свободные жирные кислоты, пропускают через колонку, в результате чего происходит поглощение свободных жирных кислот

N (R) НСO₃ + RCOOH→ N (R) OCOR+ Н₂СO₃.

Затем смолу промывают 29 мл четыреххлористого углерода и колонку на 15-20 мин присоединяют к водоструйному насосу. Далее смолу пересыпают в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 %-ным раствором йодистого метила в эфире и выдерживают 24 ч.

Метилирование поглощенных смолой кислот осуществляется по следующей схеме:

N (R)₃OCOR+ С→ N (R)₃I + CH₃OCOR.

По окончании выдерживания смолу тщательно перемешивают, надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку и смолу промывают эфиром. Объединенные растворы метиловых эфиров жирных кислот осторожно упаривают до определенного объема, после чего их можно применять для газохроматографического анализа.

Анализ аромата пищевых продуктов. Аромат пищевых продуктов обусловлен многокомпонентной смесью веществ различной химической природы.

Многие из этих веществ присутствуют в количествах, не детектируемых современными приборами, или имеют низкие по­роговые концентрации (10^-12-10^-14 частей в единице объема или массы), что затрудняет изучение компонентов ароматического комплекса и заставляет использовать специальные методы выделения и концентрирования аромата.

Наиболее эффективны следующие методы извлечения летучих веществ: отгонка с паром, вакуумная дистилляция, отгонка в токе инертного газа при атмосферном или пониженном давлении (газовая экстракция), экстракция легколетучими органическими растворителями или сжиженным газом.

В процессе отгонки с паром при температуре более 100 °С наблюдается расщепление некоторых соединений, поэтому летучие высококипящие компоненты предпочтительнее выделять в токе сухого или влажного инертного газа.

Недостаток газовой экстракции–образование новых соединений и потеря веществ при улавливании.

Основной недостаток экстракции легколетучими органическими растворителями (пентаном, серным эфиром, хлористым этилом, этилацетатом и смесями этих растворителей)–выделение вместе с летучими компонентами нелетучих веществ (пигментов, липидов и т.д.). Кроме того, нельзя полностью количественно извлекать некоторые летучие вещества. Наибольшее распространение получил метод вакуумной дистилляции.

В последнее время получает распространение метод анализа летучих компонентов в насыщенных парах над поверхностью измельченного продукта в закрытом сосуде. Метод состоит в том, что продукт выдерживают несколько часов при 25-30 °С либо заливают горячей водой (90-100 °С). После этого шприцем отбирают 6-10 мл насыщенного пара и хроматографируют.Этот метод позволяет изучить вещества, обусловливающие аромат продукта.

Рекомендуемая литература

а) основная литература

1. Измерительные методы контроля показателей качества и безопасности продуктов питания. Ч.1. Продукты растительного происхождения/В.В. Шевченко, А.А.Вытовтов, Л.П.Нилова, Е.Н.Карасева – СПб.: «Троицкий мост», 2009.– 198с.

2. Измерительные методы контроля показателей качества и безопасности продуктов питания. Ч.2. Продукты животного происхождения /В.В. Шевченко, А.А.Вытовтов, Л.П. Нилова, Е.Н.Карасева – СПб.: «Троицкий мост», 2009.– 304с.

б) дополнительная литература

1. Вытовтов А.А., Грузинов Е.В., Шленская Т.В. Физико-химические свойства и методы контроля качества товаров. – Санкт-Пет.: ГИОРД, 2007. – 170с.

2. Зимон А.Д. Коллоидная химия. М.: Агар, 2007. – 344с.

3. Коренман Я.И. Практикум по аналитической химии. Анализ пищевых продуктов: в 4-х книгах. Книга 1. Титриметрические методы анализа. – М.: Колос С, 2005. – 239с.

4. Коренман Я.Н. Практикум по аналитической химии. Анализ. пищевых продуктов: в 4-х книгах. Книга 2. Оптические методы анализа. – М.: КолосС, 2005. – 288с.

5. Коренман Я.И. Практикум по аналитической химии. Анализ пищевых продуктов: в 4-х книгах. Книга 3. Электрохимические методы анализа. – М.: КолосС, 2005. – 232с.

6. Коренман Я.И. Практикум по аналитической химии. Анализ пищевых продуктов: в 4-х книгах. Книга 4. Хроматографические методы анализа. – М.: КолосС, 2005. – 296с.

7. Химический состав российских пищевых продуктов: Справочник /Под ред. Член-корр. МАИ, проф. И.М. Скрухина и академика РАМН, проф. В.А. Тутельяна. – М.: ДеЛипринт, 2002. – 236с.

8. Контроль качества продукции физико-химическими методами. 4.Вино и виноматериалы / Ашапкин В.В., Кутцева Л.И., Захарова М.Г. и др. – М.: ДеЛиприн, 2005. – 124с.

9. Срок годности пищевых продуктов: Расчет и испытания /Под.Ред.Р. Стеле; пер. с англ. В. Широкова под общ. ред. Ю.Г. Базарновой. – СПб.: Профессия, 2006. – 480с.

10. Физические методы контроля сырья и продуктов в мясной промышленности (лабораторный практикум) / Л.А. Антонова, Н.Н.Безрядин, С.А. Титов и др. – СПб.: ГИОРД, - 2006. – 200с.

11. Васильев В.П. Аналитическая химия. Книга 2. Физико-химические методы анализа. – М.: Дрофа, 2004. – 384с.

12. Основы аналитической химии. Книга 2. Методы химического анализа / Под ред. Ю.А.Золотова – М.: Высшая школа, 2004. – 503с.

13. Контроль качества продукции физико-химическими методами. 4.Вино и виноматериалы / Ашапкин В.В., Кутцева Л.И., Захарова М.Г. и др. – М.: ДеЛи принт, 2005. – 124с.

14. Сычев С.Н., Гаврилина В.А., Музалаевская Р.С.Высокоэффективная жидкостная хроматография как метод определения фальсификации и безопасности продукции. – М.: ДеЛи принт, 2005. – 148с.

15. Пентин Ю.А., Вилков Л.В. Физические методы исследования в химии. – М.: Мир, 2003. – 532с.

16. Рудаков О.Б., Пономарев А.Н, Полянский К.К., Любарь А.В.Жиры. Химический состав и экспертиза качества. – М.: ДеЛи принт, 2005. – 312с.

17. Чечеткина Н.М., Путилина Т.И., Горбунева В.В. Товарная экспертиза. – Ростов н/Д: «Феникс», 2000. – 512 с.