Метод количественного определения белков по Кьельдалю

Методом Кьельдаля определяют количество общего азота и раздельно белкового и небелкового азота. Принцип метода заключается в том, что навеску исследуемого продукта минерализуют (сжигают) концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора. При минерализации навески все органические вещества окисляются до СО₂ , Н₂О и NH_3/ Углекислота и вода удаляются, а аммиак сохраняется в растворе, так как реагирует с избытком серной кислоты и образует с ней сульфат аммония:

R-CH-NH₂ –COOH + H₂ SO₄ → CO₂ ↑ + SO₂↑ + H₂ O+ NH₃

2 NH₃ + H₂ SO₄ → (NH₄ )₂ SO₄ ↓

После окончания сжигания навески избыток кислоты нейтрализуют щелочью, избыток которой вытесняет аммиак из сульфата аммония:

(NH₄ )₂ SO₄ + 2 NaOH → Na₂ SO₄ + 2 NH₄ OH

2 NH₄ OH→ 2 NH₃ ↑ + 2H₂ O.

Выделившийся аммиак количественно определяют методами кислотно-щелочного титрования, йодометрии, колориметрии.

В различных модификациях метод Кьельдаля является самым распространенным стандартным и арбитражным методом определения азота в биологических объектах. При определении азота макрометодом масса навески продукта, предназначенного для сжигания, устанавливают с таким расчетом, чтобы в ней содержалось 20-70 мг азота. При определении азота микрометодом для отгонки аммиака используют только часть кислотной смеси, полученной после минерализации указанной выше навески, или всю смесь, полученную при сжигании навески, содержащей 2-3 мг азота.

Для определения общего азота навеску берут массой 0, 3-0, 5 г в маленьий бумажный кулек из фильтровальной бумаги. Кулек с навеской опускают в колбу Кьельдаля, предназначенную для сжигания(минерализации). В колбу с навеской продукта добавляют 15-20 мл концентрированной серной кислоты и катализатор (соли меди, калия, селена, перекись водорода, марганцевокислый калий или хлорную кислоту).

Для сжигания колбу укрепляют на штативе в наклонном положении под углом 40°, помещают в вытяжной шкаф на асбестовые с электрическим или газовым обогревом сетки. Во избежание выкипания и разбрызгивания жидкости в горло колбы Кьельдаля рекомендуется вставлять стеклянную грушу или небольшую воронку. Выходящие пары воды и серной кислоты, образующиеся при сжигании, конденсируются на них и стекают обратно в колбу.

Минерализация продолжается 5-6 часов. Конец сжигания определяют по внешнему виду реакционной смеси- по полному ее просветлению, по получению прозрачного бесцветного или зеленовато-голубоватого раствора.. сожженная смесь разбавляется водой еще в теплом состоянии, так как при полном охлаждении и выпадают сернокислые соли, которые медленно растворяются водой.

Для полной нейтрализации смеси и вытеснения аммиака в отгонную колбу добавляют 33% -ный раствор едкого натра:

(NH₄ )₂ SO₄ + 2NaOH → Na₂ SO₃ + H₂ O + 2NH₃↑

В модифицированных методиках для отгонки аммиака используют разные по конструкции приборы. Общим для всех приборов является прочное сочленение всех частей прибора, исключающее потери аммиака при отгонке; наличие приемной колбы с раствором кислоты, в которую из отгонной колбы по трубкам через каплеуловитель и холодильник поступает дистиллят. Отгонку продолжают до тех пор, пока дистиллят не покажет отрицатекльной реакции на аммиак. Это можно проверить индикаторной бумагой. Обычно процесс от гонки заканчивается через 40-60 мин.. После полной отгонки трубку смывают дистиллированной водой, приемную колбу снимают от прибора и отгонку прекращают. Выделившийся аммиак связывают раствором 0, 05 моль/дм³ серной кислоты, налитой в приемную колбу в количестве 30 мл:

2NH₃ + H₂ SO₄ → (NH₄ )₂ SO₄

По окончании отгонки избыток серной кислоты в приемной колбе оттитровывают 0, 1 н едким натром в присутствии смешанного индикатора до перехода окраски в зеленую. Параллельно с определением азота в исследуемой пробе необходимо проводить определение азота в реактивах («холостой опыт» для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Массовую долю азота (Х) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака вычисляют по формуле:

Х = ;

где V₂ – объем 0, 1 моль/дм³ раствора гидроокиси натрия, израсходованной на титрование 0, 5 моль/дм³ серной кислоты в контрольном опыте, см³

V₁ – объем моль/дм³ раствора гидроокиси натрия, израсходованной на титрование 0, 5 моль/дм³ серной кислоты в исследуемом рабочем опыте, см³ ;

К- поправка к титру 0, 1 моль/дм³ раствора гидроокиси натрия;

0, 0014- количество азота, эквивалентное 1см³ 0, 05 моль/дм³; М- масса навески, г

Установка для определения общего азота по Кьельдалю показана на рисунке 1.