Гбоу ВПО рниму ИМ. Н. И. Пирогова Минздрава России.

ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ РАННЕЙ БУЛЛЕЗНОЙ КЕРАТОПАТИИ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

А.А. Каспаров1, Евг.А. Каспарова1, Л.Л. Фадеева2, А.М. Суббот1, 3, Н.В. Бородина1, Е.А. Каспарова1, М.В. Кобзова1, Г.М. Мусаева1, А.С. Павлюк1, 3.

¹ФГБУ НИИ глазных болезней РАМН,

²Институт вирусологии им. Ивановского РАМН,

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.

Буллезная кератопатия (БК) или эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы – часто встречающееся патологическое состояние, развивающееся вследствие декомпенсации функции роговичного эндотелия и характеризующееся стойким отеком роговицы [11].

Развитие послеоперационной буллезной кератопатии (ПБК) происходит в результате потери эндотелиальных клеток (ЭК) роговицы во время хирургических манипуляций.

В англоязычной медицинской литературе ранняя ПБК описывается термином «внезапная буллезная кератопатия» или «внезапный необратимый отек роговицы» («irreversible immediate corneal edema», «irreversible BK») возникший «на операционном столе» и неразрешающийся за всё время наблюдения [16, 24, 32].

Следует отметить, что консервативное лечение ПБК неэффективно, а большинству хирургических методов лечения свойственны те или иные недостатки, которые ограничивают область их клинического применения.

Эффективной может оказаться клеточная терапия (КТ), однако в этом случае требуется решение ряда вопросов: необходимо иметь постоянно доступный источник клеток, использовать безопасный и экономичный метод их выделения и процессинга, исключить или в крайнем случае минимизировать возможность развития иммунологического конфликта, обеспечить полную биологическую безопасность для пациента, реально оценивать техническую сложность применяемых методов, материальных затрат, законодательных и этических ограничений.

Решением вышеперечисленных проблем являются технологии персонализированной клеточной терапии, в которых для лечения пациента используются его собственные (аутологичные) клетки, полученные и сохраненные заранее либо полученные непосредственно перед проведением лечения [13, 25]. Естественно, что для каждой конкретной клеточной технологии будет характерен уникальный алгоритм получения, хранения, процессинга и применения аутологичных клеток или клеточного продукта.

В ФГБУ НИИ глазных болезней РАМН коллективом авторов (А.А. Каспаров, Евг.А. Каспарова, А.С. Павлюк) разработан и применяется метод персонализированной клеточной терапии (ПКТ), известный по прежним публикациям как локальная экспресс-аутоцитокинотерапия (ЛЭАЦКТ). Метод применяется в двух модификациях – наружная ПКТ и интракамеральная ПКТ. Наружная ПКТ предполагает субконьюнктивальное введение и инстилляции смеси цельной аутологичной крови и комплекса полиА: У (препарата Полудан). Такая модификация используется при эпителиально-стромальных поражениях роговицы и коньюнктивы (упорные и часто рецидивирующие герпетические кератиты, осложненные аденовирусные кератоконъюнктивиты, термохимические ожоги 1-2 степени, замедленная реэпителизация после фоторефракционной и фототерапевтической кератэктомии).Метод интракамеральной ПКТ заключается в инкубации in vitro крови пациента со стимулятором (Полуданом), сборе сыворотки со взвешенными в ней активированными лейкоцитами и введении полученного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза пациента. Приоритет на изобретение закреплен патентами на изобретения: № 2165747 «Способ лечения поствоспалительной буллезной кератопатии» и № 2357743 «Средство для лечения, способ получения средства для лечения и способ лечения отека роговицы и других проявлений ранней буллезной кератопатии».

Далее в данной статье под термином ПКТ мы будем подразумевать интракамеральную модификацию ПКТ.

Спектр стимуляторов, используемых для проведения КТ, ограничен теми субстанциями, применение которых разрешено законодательно. В случае интраоперационной ПКТ в офтальмологии, препарат должен быть разрешен к внутриглазному введению.

При приготовлении клеточного препарата для ПКТ используется синтетический комплекс полиадениловой-полиуридиловой кислот, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3 и 7 типа, препарат Полудан, разрешенный к внутриглазному применению и более 10 лет успешно применяющийся в офтальмологической практике [30]. Кроме того, на клетки оказывают активирующее влияние и другие процессы – свертывание крови, имитирующее течение раневого процесса, температура 37°С, увеличивающая интенсивность синтетических процессов.

Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и стандартизация клеточного продукта [5]. Мы провели ряд исследований, в результате которых было установлено, что предлагаемый метод сбора клеток в аутологичной сыворотке вокруг сгустка свернувшейся крови, позволяет получить КП с высоким содержанием жизнеспособных клеточных элементов, из 8 мл крови можно получить 2-4 мл КП с концентрацией ядросодержащих клеток 3× 10⁶ кл/мл и жизнеспособностью 70-90%.

Было исследовано, какие именно клеточные популяции входят в состав КП - установлено, что соотношение гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов отличается от соотношения в цельной крови - содержание мононуклеарной фракции снижено в 1, 3 раза и увеличена доля гранулоцитов, T-хелперы, T-цитотоксические и NK-клетки присутствуют в КП в тех же пропорциях, что и в периферической крови, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в 5 раз [1].

Первое исследование эффективности ПКТ было проведено у больных с ранними проявлениями герпесвирусного кератоиридоциклита и эндотелиита, имевшего тенденцию к прогрессированию. ПКТ оказалась более эффективной чем лечение одним Полуданом интракамерально. Выздоровление было достигнуто у 84% и 56% больных соответственно (p< 0, 01). Средняя острота зрения существенно возросла в группе ПКТ: 0, 11±0, 2 до лечения и 0, 6±0, 3 после.

Обнаруженная значимая разница в эффективности лечения (28%), по нашему мнению, была связана с более выраженным терапевтическим воздействием ПКТ на патологический процесс в эндотелии и задних слоях стромы роговицы по сравнению с одним полуданом.

Учитывая сходство клинической картины при буллезном герпетическом увеокератите и ранней ПБК - наличие воспалительного компонента в их патогенезе, поражения эндотелия, подтвержденные патогистологическими исследованиями [3, 5], а также отметив высокую клиническую эффективность методики ПКТ, и ее выраженный регенераторный, противовоспалительный и противоотечный эффекты, мы решили применить ее в лечении ранней ПБК [6, 7, 8, 31, 14].

Для каждого конкретного метода КТ вопрос о механизмах лечебного действия требует отдельного изучения, однако принято считать, что механизмами обусловливающими эффективность любой КТ являются: а) заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая её функцию и б) трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [18, 22]. Поэтому нами было проведено определение в составе КП, биологически активных веществ – цитокинов и факторов роста, которые могут играть центральную роль в механизмах реализации его терапевтических эффектов [2]. Значения приведены в таблице 1.

Таблица 1 Концентрация цитокинов и факторов роста в клеточном препарате (пг/мл, М±sd, в скобках – число наблюдений).

Установлено что цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:

1. выделенных в ответ на стимуляцию полиА: У (ИФ-α, ИЛ-1, -6, ФНО-α);

2. спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8);

3. предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGF-β 1, PDGF-AB, TGF-β 2, VEGF, ИФ-γ и ИЛ-4).

Можно предположить, что при проведении интракамеральной ПКТ и замене водянистой влаги передней камеры глаза на КП, наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGF-β 1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения [15, 19, 27, 33].

Известно, что и другие обнаруженные цитокины играют роль в процессах регенерации. Так, ФНО-α регулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами после деструкции роговицы [28, 29]. Провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, чем, предположительно, стимулируют эндотелий роговицы к делению, снимая один из механизмов его ингибирования [20].

Результаты определения цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис.1).

Рисунок 1. Предполагаемые цитокиновые механизмы реализации лечебных эффектов ПКТ.

Выделившиеся в результате стимуляции полиА: У провоспалительные цитокины, вкупе с ИЛ-8, ослабляют межклеточные контакты, чем снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам поделиться или мигрировать и закрыть зону дефекта. Антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена, они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия. Прямой противовирусный эффект обеспечивается наличием в КП ИФα.

Все вышеозначенные процессы приводят к наблюдаемому эффекту – восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы. После интракамеральной инъекции КП начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов лейкоцитами продолжаются in vivo в передней камере глаза, таким образом, обеспечивается пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ, обусловливающих клинический эффект ПКТ.