Качественное и количественное определение белков в пищевых продуктах

Цель работы: изучить качественные и количественные методы определения белков в пищевых продуктах.

Выделение белков из растительного сырья

Принцип метода. Метод основан на проведении качественных реакций на наличие водорастворимых белков растительного сырья.

Приборы: стеклянные воронки, фарфоровые ступки и пестики, фильтровальная бумага, марля, плоскодонные колбы объемом 100 мл, пробирки, пипетки, водяная баня, технические весы.

Реактивы: мука пшеничная; 10 % и насыщенный растворы сульфата аммония, сухой сульфат аммония (мелко размолотый); 10 % раствор NaOH; 1 % раствор CuSO₄; 0, 5 % раствора нингидрина; 30 % раствор NaOH; 5 % раствор ацетата свинца; концентрированная азотная кислота; 30 % раствор NaOH; концентрированная уксусная и серная кислоты; дистиллированная вода.

Техника выполнения:

1. Пшеничную муку в количестве 6г растереть в фарфоровой ступке с
30 мл дистиллированной воды. Полученной смеси дать отстояться 2-4 мин, затем отфильтровать. Остаток муки промыть два раза небольшими порциями дистиллированной воды и оставить для последующего извлечения глобулинов пшеницы. Полученный фильтрат использовать при исследовании растворимости альбуминовых белков.

2. К фильтрату альбуминовой фракции белков добавить сухой тонкоизмельченный порошок сульфата аммония при небольшом нагреве (не выше 40 ^оС) до полного насыщения (до прекращения растворения сульфата аммония). Выпавший осадок, представляющий собой альбуминовую фракцию белков пшеницы, отфильтровать.

3. Осадок на фильтре растворить в 6 мл дистиллированной воды. Полученный раствор разделить на 6 пробирок (по 1 мл) и доказать наличие в них белков, и соответствующих аминокислот, проведя следующие реакции:

Биуретовая реакция (на обнаружение пептидных связей в белках). К 1 мл полученного раствора белка добавляют 1 мл 10 % раствора щелочи (NaOH) и 1 каплю 1 % раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.

Нингидриновая реакция (на аминогруппу, находящуюся в a-положении). К 1 мл полученного раствора белка прибавляют 0, 5 мл 0, 5 % раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание.

Реакция Фоля (на цистеин и цистин). К 1 мл полученного раствора белка добавляют 1 мл 30 % щелочи и 3-4 капли 5 % раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет.

Ксантопротеиновая реакция (на ароматические аминокислоты). К 1 мл полученного раствора белка прибавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель 30 % раствора NaOH, при этом желтая окраска переходит в оранжевую.

Реакция Адамкевича (на триптофан). К 1 мл полученного раствора белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.

4. Сделать вывод о наличии аминокислот в растительном сырье.

Определение массовой доли белков в молоке и молочных продуктах

рефрактометрическим методом

Принцип метода. Метод основан на установлении разности показания преломления луча света, проходящего через молоко, и выделенную из нее (после осаждения казеина хлористым кальцием) сыворотку.

Приборы: рефрактометр, водяная баня, флаконы емкостью 5 см³ с резиновыми пробками, пипетка емкостью 5 см³, стеклянная палочка с оплавленными концами, ватные тампоны, салфетка.

Реактивы: 4 %-й раствор хлористого кальция

Техника выполнения:

1. Устанавливают на ровную поверхность стола рефрактометр и подключают его к электросети.

2. Промывают дистиллированной водой плоскости измерительной и осветительной призм, после чего насухо вытирают.

3. Стеклянной палочкой на нижнюю призму наносят 3 капли молока. Верхней призмой закрывают нижнюю.

4. Устанавливают осветитель над отверстием верхней призмы. Наблюдаем за полем зрения в окуляр, вращают винт окуляра до появления в поле зрения четко видимых штрихов юстировочной шкалы и сетки.

5. Наблюдая через окуляр, вращают рукоятку до тех пор, пока в поле зрения не будет установлена четкая граница между темным (верхняя часть) и светлым (нижняя часть) полем зрения. Три пунктирных линии юстировочной шкалы должны находиться напротив линии, отделяющей темную часть шкалы от светлой. По шкале делают показания стрелки (Б_м).

7. Приготавливают сыворотку – во флакон емкостью 10 см³ отмеривают 5 см³ молока, добавляют 5-6 капель 4 %-го раствора хлористого кальция. Закрывают флакон резиновой пробкой и содержимое размешивают путем встряхивания. Флаконы помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Уровень воды в бане должен достигать половины высоты флаконов. При нагревании молока с хлористым кальцием белок осаждается. Флаконы охлаждают 2-3 мин и встряхивают, чтобы конденсат на стенках смешался с сывороткой.

8. Через ватный тампон отбирают из флакона стеклянной трубкой выделившуюся сыворотку, наносят 3-4 капли на нижнюю призму и накрывают верхней.

9. Проделывают операции п.4 и 5. По шкале для белка делают отчет показания стрелки (Б_с). Призмы насухо вытирают и кладут между ними фильтровальную бумагу.

10. Производят расчет белка по формуле:

Б = Б_м – Б_с,

где Б массовая доля белка в молоке, %; Б_м – показатель отсчета по шкале при нанесении на призму молока; Б_с – показатель отсчета по шкале при нанесении на призму сыворотки.

10. Сделать вывод.

Вопросы для контроля знаний:

1. Какие органические вещества относят к классу белков?

2. Как классифицируются белковые вещества?

3. Назовите функциональные свойства белков.

4. Какие физико-химические превращения белков происходят при производстве пищевых продуктов?

5. Какая суточная норма потребления белка для взрослого человека?

6. Как определяется биологическая ценность пищевых продуктов?

7. Назовите известные вам методы определения белков.

Лабораторная работа № 3.