Азотфиксация

Цикл азота

Только прокариоты способны использовать запасы азота, содержащиеся в атмосфере, -фиксировать молекулярный азот. Частью самостоятельно, а частью в симбиозе с высшими растениями они переводят инертный N2 в органические соединения и включают его (непосредственно или через растения) в белок, который в конечном счете попадает в почву. В результате связывания N2 клубеньковыми бактериями в симбиозе с растениями семейства бобовых почва ежегодно обогащается азотом в количестве 100-300 кг на 1 га. Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы вносят в почву 1-3 кг азота на 1 га в год. Кроме того, значительные количества связанного азота могут попадать в почву из атмосферы с осадками.

немногим бактериям, относящимся в основном к родам Clostridium и Azotobacter. Положение изменилось, когда начали применять метод изотопных индикаторов (15N2), а также реакцию с восстановлением ацетилена, выявляющую нитрогеназу-ферментный комплекс, связывающий N2; тогда выяснилось, что такой способностью обладают и многие другие бактерии, в том числе большин ство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, факультативные анаэробы (Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa), xe-молитоавтотрофные бактерии (Xanthobacter autotrophicus, Alcaligenes latus), метилотрофные, сульфатредуцирующие и метанобразующие бактерии.

Особенно эффективно связывают азот виды Azotobacter (около 20 мг азота на 1 г использованного сахара). Различают несколько видов Azotobacter, распространенных в разных местообитаниях. Все они грам-отрицательные, относительно крупные, в определенных условиях передвигаются с помощью жгутиков; все-строгие аэробы, способные окислять многие органические соединения. У A. chroococcum клетки соединены попарно. Обильное образование слизи и наличие темных пигментов (меланинов) придают колониям характерный вид. При недостатке питательных веществ образуются цисты с толстыми клеточными стенками («артроспоры», «микроцисты»).

Азотфиксирующие бактерии были найдены в области корневой си стемы многих культурных растений; Azotobacter paspali растет на поверхности корней Paspalum notatum, а в ризосфере Digitaria decumbens обнаружена бактерия Azospirillum lipoferum.

В чистых культурах способность связывать азот установлена примерно у 40 видов цианобактерии. Эти организмы одни из первых заселяют бедные (например, вулканические) почвы. Их можно встретить в самых экстремальных местообитаниях и в Антарктиде при температурах, близких к точке замерзания, и в горячих источниках. Живут они либо изолированно, либо в симбиозе с грибами (лишайники). Во внутренних водоемах и в некоторых областях океана ежегодно наблюдается массовое развитие цианобактерий, так называемое «цветение воды». Пока еще не выяснено, в какой мере цианобактерий участвуют в накоплении азота и продукции биомассы в морях.

Для фиксации молекулярного азота необходим молибден. Этот тяжелый металл входит в состав нитрогеназы.

Для связывания N2 бобовыми растениями необходим, кроме того, кобальт. Он содержится в коферменте В12, который действует как кофактор ферментов метилмалонил-СоА-мутазы и нуклеотидредуктазы. Подобно Lactobacillus leichmanii, ризобии тоже нуждаются в этом кофакторе. Для некоторых азотфиксирующих организмов молибден можно заменить ванадием.

Связывание N2-это восстановительный процесс, и первым его продуктом, который можно обнаружить, является аммиак. Процесс восстановления происходит на ферментном комплексе - нитрогеназе. Нитрогеназа состоит из двух компонентов: белка, в состав которого входят молибден, железо и сера, и белка, содержащего железо и серу. Как сам фермент, так и процесс фиксации N2 отличаются крайней чувствительностью к молекулярному кислороду. Это позволяет понять, почему как у свободноживущих азотфиксирующих бактерий, так и в ткани клубеньков есть особые механизмы, защищающие нитрогеназу от высокого парциального давления кислорода.

Для связывания молекулярного азота необходимы восстановительная сила и энергия, которые могут быть получены в процессе фотосинтеза, брожения или дыхания. В модельных экспериментах с очищенными компонентами нитрогеназной системы (in vitro) можно доставлять энергию в виде АТР и восстановительную силу в форме восстановленных пиридиннуклеотидов и ферредоксинов, используя переносчики, содержащие флаводоксин. Затраты АТР при этом очень высоки.

Нитрогеназная система восстанавливает не только молекулярный азот (N=N), но и ацетилен (НС=СН), азид, закись азота, цианид, нитриты, изонитрилы и протоны. На восстановлении ацетилена основан наиболее простой метод, позволяющий выявить нитрогеназу. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддается количественному определению с помощью газовой хроматографии. Все до сих пор исследованные азотфиксирующие микроорганизмы и симбиотические системы способны восстанавливать ацетилен.

У многих бактерий нитрогеназа образуется только тогда, когда она необходима, т. е. в отсутствие подходящего источника связанного азота. Ионы аммония подавляют синтез нитрогеназы. У пурпурных и зеленых бактерий под влиянием этих ионов уменьшается также активность уже синтезированного фермента. В регуляции образования нитрогеназы большую роль, очевидно, играет глутаминсинтетаза. Глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза нужны бактериям для включения ионов аммония в органические соединения в том случае, если эти ионы присутствуют лишь в низкой концентрации. Эта система обладает высоким сродством к ионам аммония и поддерживает их концентрацию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) подавляет образование глутаминсинтетазы, а в результате и нитрогеназы.

Бактерии, вызывающие образование клубеньков у бобовых растений (клубеньковые бактерии), относятся к роду Rhizobium. При свободном существовании в почве эти аэробные грамотрицательные палочки растут как сапрофиты за счет органических соединений. По специфичности в отношении растения-хозяина, а также по некоторым другим признакам различают несколько видов клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R.trifolii, R. phaseoli, R. lupini, R. japonicum и др.).

Заражение растения происходит только через молодые корневые волоски. Бактерии внедряются на самом конце или около конца волоска и растут в форме инфекционной нити до его основания. Затем такие нити, одетые целлюлозной оболочкой, проникают сквозь тонкие стенки молодых клеток эпидермиса в кору корня. Натолкнувшись здесь на одну из тетраплоидных клеток коры, нить стимулирует деление как самой этой клетки, так и соседних диплоидных клеток. Инфекционные нити разветвляются и распределяются по тетраплоидным клеткам. В результате такого разрастания тканей, вызванного Rhizobium при участии ростового вещества, происходит образование клубеньков. Бактерии в клубеньках размножаются очень быстро и образуют крупные клетки неправильной формы (бактероиды), объем которых может в 10-12 раз превышать объем свободноживущих Rhizobium; бактероиды располагаются по отдельности или группами, окруженные мембраной, в цитоплазме растительных клеток. Ткань, заполненная бактериями, имеет красноватую окраску-она содержит пигмент леггемоглобин, родственный гемоглобину. Молекулярный азот фиксируют только те клубеньки, в которых имеется леггемоглобин; «пустые», не содержащие пигмента клубеньки к фиксации азота не способны. Появление пигмента в ткани совпадает по времени с началом фиксации N2. При разрушении леггемоглобина с образованием зеленых желчных пигментов (биливердинов) прекращается и связывание азота. Леггемоглобин, по всей вероятности, находится в цитоплазме растительной клетки, а не в пространствах между бактероидами и окружающими их мембранами. Образование пигмента-это специфический результат симбиоза: простетическая группа (протогем) синтезируется бактероидами, а белковый компонент-при участии растения. Леггемоглобин сходен с миоглобином, в клубеньках он представлен в основном Ре(П)-содержащей формой. Этот пигмент обладает высоким сродством к кислороду. Можно предполагать, что леггемоглобин облегчает диффузию кислорода через клетку растения к бактероиду. Благодаря особым свойствам леггемоглобина бактероиды снабжаются кислородом в количестве, достаточном для их роста и для получения энергии, и в то же время не создается слишком высокого парциального давления 02, неблагоприятного для фиксации азота бактероидами.

Пока еще недостаточно выяснено, что лежит в основе специфичности симбиоза Rhizobium с растением-хозяином. Согласно новой гипотезе, которую сейчас пытаются проверить, уже при первом контакте бактерий с корневым волоском определяется, подходят ли партнеры друг к другу. Бобовые растения содержат лектины-гликопротеины, способные специфически связывать полисахариды. Лектины широко распространены в природе и выполняют, по-видимому, функцию распознавания. Предполагают, что лектины находятся на наружной поверхности корневых волосков; в то же время наружный слой клеточной стенки Rhizobium содержит видоспецифичные полисахаридные цепи. Возможно, что именно взаимодействие лектинов корневого волоска с поверхностными полисахаридами Rhizobium определяет, будет ли волосок инфицирован.

В том случае, если партнеры совместимы, возникает истинный симбиоз между растением и Rhizobium.Растение обеспечивает бактерий питательными веществами (главным образом сахарами) и создает для них оптимальные условия. Когда растение отмирает, в почву попадает больше жизнеспособных бактерий, чем там могло бы расти без симбиотической ассоциации. Фиксация N2 происходит только в бактероидах, причем около 95% фиксированного азота переходит в виде ионов аммония в цитоплазму растения-хозяина.

Помимо корневых клубеньков встречаются также клубеньки на стеблях, содержащие бактероиды Rhizobium; такие стеблевые клубеньки образуются, например, у влаголюбивого бобового растения централь ной Африки Sesbania rostrata.

Маловероятно, что и свободно живущие в почве ризобии способны фиксировать N2. Лишь у немногих штаммов удалось обнаружить в колониях на агаризованной питательной среде нитрогеназу. Образование нитрогеназы в колониях зависело от парциального давления 02.

У некоторых растений, не относящихся к бобовым, тоже имеются корневые клубеньки, способные фиксировать N2. Фиксация азота и здесь основана на симбиозе с прокариотами. В случае эндосимбионтов речь идет в большинстве случаев об актиномицетах, принадлежащих к роду Franckia.

Хозяевами актиномицетов-симбионтов могут быть как древесные, так и травянистые растения. Они распространены по всему свету и первыми появляются в местах, где почва бедна азотом. Накопление азота в почве при участии таких растений может достигать 150-300 кг на 1 га в год и имеет поэтому большое хозяйственное значение. К растениям, наиболее эффективно связывающим азот, относятся Casuarinaequisetifolia, ольха (Alnus), облепиха (Hippophae) и Ceanothus; менее эф фективны в этом отношении восковница (Myrica), куропаточья трава (Dryas), лох (Elaeagnus) и Shepherdia.

Корневые клубеньки древесных растений могут достигать размеров теннисного мяча. Они представляют собой густые сплетения корней, разветвленных наподобие кораллов и прекративших рост. У казуарины клубеньки состоят из рыхлого пучка утолщенных корней с отрицательно геотропным ростом. Бактерии-симбионты инфицируют только паренхимные клетки в коре корня. Так же как и у бобовых, инфекция проникает в корни из почвы через корневые волоски; в клубеньках тоже образуется леггемоглобин. Лишь недавно у одного из растений, не от носящихся к бобовым, -Parasponia parviflora (ильмовые)-был обнаружен в качестве эндосимбионта штамм Rhizobium. Удалось даже перенести этот штамм на бобовые растения. Клубеньки древесных растений активно фиксируют N2.

Симбиозы с азотфиксирующими цианобактериями. Цианобактерии то же могут быть фиксирующими азот партнерами в симбиозе с высшими растениями. У водного папоротника Azolla, растущего на поверхности стоячих тропических водоемов, цианобактерии содержатся в полостях листьев. В то время как свободкоживущие виды Anabaena содержат лишь немного (5%) гетероцист, в трихомах симбиотических видов 15-20% клеток составляют гетероцисты. Такое соотношение само по себе указывает на активное связывание азота. Измерения активности нитрогеназы подтверждают это предположение. Azolla растет на поверхности зато пленных рисовых полей и может при надлежащей агротехнике полностью удовлетворить потребность риса в азоте. Накопление азота в почве в результате симбиоза Anabaena с Azolla составляет около 300 кг/га в год. Сходный симбиоз наблюдается между печеночниками (Blasia pusilla, Anthoceros punctatus, Peltigera) и Nostoc.

У тропического кустарника Gunnera macrophylla симбиотические цианобактерии Nostoc punctiforme находятся в нижней части ствола, а именно в специальных железах в местах отхождения листовых черешков. Этот вид Nostoc тоже образует гетероцисты и нитрогеназу.