Определение группы крови стандартными изогемагглютинирующими сыворотками

1. Специальное оснащение:

- стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О aß (I), А ß (II), В а(III) и АВ о(IV), титр

не менее 1: 32; - 2 серии;

- изотонический 0, 9% раствор хлорида натрия;

- белые фарфоровые или любые другие белые планшеты со смачиваемой поверхностью;

- пипетки, маркированные для каждой группы сыворотки;

- стеклянные, пластмассовые палочки или другой материал для перемешивания капель

крови и сыворотки каждой группы в отдельности;

- песочные часы на 5 мин. (таймер с сигналом);

- цветные марки с указанием группы крови; штативы для пробирок;

- пробирки 10x100 мм;

- специальные штативы для стандартных сывороток или реагентов.

2. Техника определения группы крови при помощи стандартных сывороток.

- Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при темпе­ратуре +15 -+25°С.

- На пластине для определения группы крови с левой стороны надписывают Оаß (анти-А+В), в середине - Аß (анти-В) и справа - Ва (анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.

- Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку наносят по одной боль­шой капле (0, 1 мл) стандартных сывороток соответствующих групп 2-х серий для исключения ложного результата. Всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: Оаß (анти-А+В), Аß (анти-В) и Ва (анти-А).

- Рядом с каждой каплей сыворотки наносят маленькую каплю (0, 01 мл) исследуемой крови, соблюдая соотношение 10: 1.

- Смешивают каплю сыворотки с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палоч­кой

- После размешивания капель пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.

- Наблюдение за ходом реакции проводится в течение 5 минут. Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, однако наблюдение следует вести, до 5 минут, ввиду возможности более поздней агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

- На 3-ей минуте в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглюти­нация, добавляют по одной капле (0, 05 мл) изотонического раствора хлорида натрия и продол­жают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5-ти минут.

Оценка результата: реакция в каждой капле может быть положительной (наличие пескообразной или лепестковой агглюти­нации эритроцитов) или отрицательной (отсутствие агглютинации).

Различные сочетания положительных и отрицательных результатов дают возможность судить о групповой принадлежности исследуемой крови (Схема 1).

Схема 1

Равномерным красным окрашиванием обозначено отсутствие агглютинации, розовое окрашивание с включениями (агглютинатами) - агглютинация.

Как видно из приведенной схемы, результат оценивается в зависимости от реакции исследуемых эритроцитов со стандартными сыворотками группы Оaß (анти-А+В), Аß (анти-В), Вa (анти-А). В тех случаях, когда положительный результат (агглютинация) получен с сывороткой всех трех групп, для исключе­ния неспецифической агглютинации производится контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо (IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглюти­нации в этой контрольной пробе позволяет учесть положительный результат с сыворотками групп Оaß (анти-А+В), Аß (анти-В), Вa (анти-А) как истинный, т.е. принадлежность исследуе­мой крови к группе АВ (IV). При наличии панагглютинации, т.е. агглютинации со всеми сыворот­ками и, соответственно, невозможности определить групповую принадлежность по системе АВО, кровь больного подлежит обязательному направлению на СПК или в ОПК для исследования специалистом-изосерологом.

Опеределение группы крови моноклональными реагентами анти-А и анти-В:

Определение группы крови системы АВО моноклональными реагентами анти-А, анти-В, анти-АВ. Реагенты анти-А, анти-В, анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными гемагглютинирующими сыворотками.

Моноклональные антитела анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами, полученными в результате слияния мышечных антителообразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Названные цоликлоны представляют разведенную асцитическую жидкость мышей – носителей гибридомы, содержащую IgM против антигенов А и В. Цоликлоны дают более быструю и более выраженную реакцию агглютинации, чем стандартные АВО-сыворотки. При использовании цоликлонов исключается передача вируса гепатита и ВИЧ.

Порядок проведения исследования.

- На планшет или пластину индивидуальными пипетками нанести реагенты анти-А, анти-В, анти-АВ по одной большой капле (0, 1 мл) под соответствующими надписями.

- Рядом с каплями реагентов нанести по одной маленькой капле исследуемой крови (0, 01-0, 03 мл).

- Смешать кровь с реагентом (в лунке планшета - тщательно вымытым сухим шариком, по­качивая планшет; на пластине - чистой индивидуальной сухой палочкой).

- Наблюдение за ходом реакции с реагентами следует вести при легком покачивании пластины или планшета в течение 5 минут. Агглютинация эритроцитов обычно наступает в первые 3-5 сек,, однако наблюдение следует продолжить ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

- Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты вид­ны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро склеивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

- Учет результатов реакции агглютинации при определении групп крови моноклональными реагентами представлен в схема 2:

Схема 2

(+) - наличие агглютинации, (-) - отсутствие агглютинации

При положительном результате реакции агглютинации со всеми реагентами необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов, для чего следует смешать на плоскости 1 каплю изотонического раствора хлорида натрия с 1 каплей исследуемых эритроцитов. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия.

Окончательный результат определения групповой и резус-принадлежности выносится на лицевую сторону медицинской карты с указанием даты и за подписью лечащего врача.