Способы иммобилизации продуцентов лакказы

Наряду с иммобилизацией ферментов широкое распространение получили методы иммобилизации самой грибной культуры. Преимуществом данных методов перед иммобилизацией ферментов состоит в том, что нахождение фермента в своем естественном окружении повышает его термостабильность и продолжительность работы в условиях технологического процесса [Биотехнология, под ред. А. А. Баева, М., 1984, А. А. Клёсов]. Кроме того, при проведении процесса исключаются затраты на выделение и очистку ферментов и продуктов реакции.

Способы иммобилизации грибной культуры схожи со способами иммобилизации лакказы: физические (адсорбция, адгезия, иммобилизация путем включения в различные гели, мембраны, волокна) и химические (метод ковалентного связывания с активированным носителем, поперечная сшивка клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами, например, глутаровым альдегидом).

Наиболее распространенными способами иммобилизации грибной культуры являются физические (включение клеток в состав гелей, мембран и волокон). При таком способе иммобилизации гриб может сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей.

Так, Черных с соавторами описали возможность иммобилизации гриба Panus tigrinus на поликапроамидных волокнах [Chernykh S.M. et al., 2005]. Авторы показали, что использование 2, 4-диметилфенола в качестве ароматического индуктора при внесении его в богатую среду вместе с 2 мМ CuSO4 на 4 сутки культивирования повышало выход фермента в 10 раз. Дополнительное введение в среду перфторана как агента, переносящего кислород, и иммобилизация гриба на поликапроамидном волокне существенно увеличили активность секретируемой в среду лакказы. В результате исследований были подобраны оптимальные условия культивирования гриба Panus tigrinus, позволившие повысить активность лакказы в среде в 25 раз по сравнению с ранее известными методами.

Chairattanamanokorn с соавторами [Chairattanamanokorn P et al., 2005] в своих исследованиях показали, что эффективность очистки сточных воды от красителей с помощью гриба Pycnoporus coccineus, иммобилизованного на частицах вспененного полиуретана, на 50 % превышает результаты, полученные при использовании неиммобилизованной глубинной культуры.

Font X. с соавторами [Font X. et al., 2006] сравнили активность лакказы гриба Trametes versicolor, иммобилизованного на частицах вспененного полиуретана и нейлоне в реакторе непрерывного действия. Исследования показали, что при использовании биомассы гриба, иммобилизованной на нейлоне, интенсивность окраски сточных вод снижается на 36%, содержание ароматических составляющих – на 54%, а токсичность сточных вод становится в 3, 15 раз ниже, чем в исходном объеме. Применение грибной культуры, иммобилизованной на частицах вспененного полиуретана, позволяет достигнуть снижения токсичности сточных вод до 5, 7 раз от исходного объема.

Livernoche с соавторами [Livernoche D. et al., 1983] оценили эффективность очистки сточных вод бумажного производства с помощью глубинной культуры и иммобилизованного мицелия гриба Coriolus versicolor в Са-альгинатных шариках. При использовании неиммобилизованного мицелия гриба Coriolus versicolor интенсивность окраски сточных вод снизилась на 60% в течение 6 суток в присутствии сахарозы. Иммобилизация гриба способствовала снижению интенсивности окраски сточных вод бумажного производства на 80% в течение 3 суток в присутствии сахарозы. При использовании иммобилизованного гриба также был обесцвечен едкий экстракт Е1. Экспериментально было установлено, что обесцвечивание происходит в аэробных условиях, скорость процесса обесцвечивания выше при значении pH равном 5, 0, чем при pH равном 7, 0.

С целью поиска более дешевого и экологичного метода деградации синтетических красителей, содержащихся в сточных водах текстильного производства, взамен существующим абиотическим методам, требующим дорогих катализаторов и реагентов, Enayatzamir с соавторами [Enayatzamir K. et al., 2009] провели иммобилизацию грибной культуры Phanerochaete chrysosporium на Са-альгинатных шариках. В данной работе была изучена способность иммобилизованной грибной культуры Phanerochaete chrysosporium обесцвечивать такие азокрасители, как Direct Violet 51 (DV), Reactive Black 5 (RB), Ponceau Xylidine (PX) и Bismark Brown R (BB). Иммобилизация гриба Phanerochaete chrysosporium осуществлялась методом гелевого покрытия для предотвращения клеточного пропускания. Иммобилизацию грибной культуры осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл питательной среды, и инкубирована на качалке с частотой вращения 150 rpm при температуре 30º С в течение 7 суток. Отношение веса Са-альгинатных шариков к объему культуральной среды составило 10% (w/v). Красители в колбы добавляли начиная с 7 суток, так как в этот период было отмечено начало выделения грибной культурой Mn-пероксидазы (50 U/L). Активность Mn-пероксидазы и эффективность обесцвечивания красителей были определены спектрофотометрически. В результате проведения исследований было установлено, что красители DV, RB и PX были практически полностью обесцвечены, а интенсивность окраски BB снизилась на 86, 7% в течение 144 часов. Далее Са-альгинатные шарики были помещены в стерилизованный раствор CaCl₂ концентрацией 2 г/л на 3 недели при температуре 4º С, а затем вновь использованы, в результате чего процесс обесцвечивания прошел более эффективно даже для наиболее устойчивого из красителей ВВ. Авторы также оценили эффективность процесса обесцвечивания вышеупомянутых красителей с помощью Mn-пероксидазы гриба Phanerochaete chrysosporium при отсутствии самой грибной культуры. Эффективность процесса обесцвечивания при использовании Mn-пероксидазы оказалась ниже, чем при использовании самой грибной культуры, несмотря на тот факт, что исходные концентрации красителей были ниже. Это свидетельствует о том, чтов процессе обесцвечивания красителей участвует весь комплекс ферментов, продуцируемых грибной культурой.

Wu с соавторами [Wu J. et al., 2007] в качестве носителей для грибной культуры Phanerochaete chrysosporium использовали Са-альгинатные шарики, Са-альгинат-поливиниловый гель и пектин с целью дальнейшей биосорбции 2, 4-дихлорфенола из сточных вод. Исследования показали, что иммобилизация мицелия гриба на пектине оказалась менее эффективной, чем на других носителях, из-за недостаточной механической прочности и низкой адсорбционной способности пектина. В свою очередь иммобилизация грибной культуры на Са-альгинатных шариках показала хорошую механическую прочность, а адсорбционная эффективность составила более 60%. Была определена оптимальная концентрация биомассы на Са-альгинатных шариках – 12, 5% (w/v). Процесс десорбции 2, 4-дихлорфенола может быть успешно осуществлен с помощью дистиллированной воды в качестве элюента, причем эффективность процесса достигает 82, 16% при оптимальном соотношении твердой и жидкой фаз, равном 14, 3. Последовательные процессы адсорбции/десорбции с использованием грибной культуры Phanerochaete chrysosporium, иммобилизованной на Са-альгинатных шариках, показали, что иммобилизованная биомасса гриба может повторно использоваться до пяти циклов подряд без значимых изменений ее адсорбционных свойств.

Petre с соавторами в качестве носителя для иммобилизации грибов Pleurotus ostreatus и Trichoderma viride использовали радиополимерный гидрогель [Petre M. et al., 2001]. Иммобилизация была произведена с целью использования полученного биокатализатора для деградации целлюлозных остатков в сточных водах винодельческого производства. Иммобилизующая матрица была получена путем радиополимеризации. Влияние процесса иммобилизации на эффективность биодеградации целлюлозных остатков было оценено путем сравнения результатов экспериментов, проведенных с использованием иммобилизованного мицелия и неиммобилизованной грибной культуры, выращенной на агаризованном сусле. Целлюлозолитическая активность иммобилизованной грибной культуры оказалась на 0, 1-0, 3 U/мин выше, чем активность неиммобилизованной культуры.

Bayramoğ lu с соавторами [Bayramoğ lu G. et al., 2003] осуществили процесс иммобилизации гриба Trametes versicolor на карбоксиметилцеллюлозных шариках с целью дальнейшего использования иммобилизованного мицелия для биосорбции ионов тяжелых металлов из водных растворов. Для достижения равномерного роста на поверхности носителя карбоксиметилцеллюлозные шарики, содержащие иммобилизованный мицелий гриба, были подвергнуты инкубации в течение 3 суток при температуре 30º С. После инкубации активная и инактивированная при высокой температуре иммобилизованная грибная культура была использована для биосорбции из водных растворов ионов Cu(II), Pb(II) and Zn(II). В качестве контрольной системы была выбрана карбоксиметилцеллюлоза.Сорбционная способность активной и инактивированной иммобилизованной культуры гриба Trametes versicolor составила 1, 51 и 1, 84ммоль Cu(II), 0, 85 и 1, 11ммоль Pb(II), 1, 33 и 1, 67ммоль Zn(II) на грамм сухого вещества сорбента соответственно. Колебание температуры в пределах 15-45º С не повлияло на сорбционную способность гриба. Максимальная адсорбция ионов Cu(II), Pb(II) and Zn(II) карбоксиметилцеллюлозой и иммобилизованной грибной биомассой была отмечена при значениях pH 4, 0÷ 6, 0. Авторами было отмечено, что карбоксиметилцеллюлозные шарики можно регенерировать с помощью 10 мM раствора HCl, восстановив при этом до 97% ионов металла. Последовательные процессы адсорбции/десорбции с использованием грибной культуры Trametes versicolor, иммобилизованной на карбоксиметилцеллюлозных шариках, показали, что иммобилизованная биомасса гриба может повторно использоваться до пяти циклов подряд без значимых изменений ее адсорбционных свойств.

С целью продуцирования экстрацеллюлярного лигнинолитического фермента Mn- пероксидазы в качестве носителя для иммобилизации мицелия гриба Clitocybula dusenii также были предложеныволокна на основе целлюлозы и полиуретана [Ziegenhagen D. et al., 2000].

D'Annibale с соавторами [D'Annibale A. et al., 1998]мв своих исследованиях использовали полиуретан в качестве носителя для иммобилизации гриба Lentinula edodes с целью дальнейшего использования иммобилизованного мицелия для очистки сточных вод оливковых маслобоен. Результатом проведенных исследований стало резкое снижение интенсивности окраски, а также общего содержания фенолов, орто-дифенолов и органического углерода в анализируемой среде.

Susana Rodrí guez Couto с соавторами [Rodrí guez Couto S. et al., 2004] в своих исследованиях осуществляли поиск подходящего носителя и технологии иммобилизации гриба Trametes hirsuta с целью очистки сточных вод текстильного производства от присутствующих в них красителей. Данная грибная культура была выбрана в связи с высоким выходом экстрацеллюлярного фермента лакказы, обладающего большим потенциалов в деградации текстильных красителей. В качестве носителей гриба Trametes hirsuta использовали различные материалы: альгинатные шарики, частицы вспененного полиуретана, нейлоновые и стальные губки.

Частицы вспененного полиуретана имели следующие характеристики: кубическая форма, объем 0.5 см³, удельный вес – 20 кг/м³, удельная площадь поверхности 414±10 м²/м³. Данные частицы предварительно были однократно промыты метанолом и дважды дистиллированной водой, а затем высушены при комнатной температуре.

Также были использованы частицы нейлоновой губки (Scotch Brite, 3M Spain, SA) размером 0, 5 см. Нейлоновая губка предварительно была подвержена кипячению в течение 10 мин и трижды промыта дистиллированной водой. Затем частицы были высушены при комнатной температуре.

Стальная губка (Scotch Brite, 3M Spain, SA) была измельчена на кусочки различного размера и подвергнута обработке аналогично методу, примененному для обработки нейлоновой губки.

Иммобилизация гриба Trametes hirsuta в Ca-альгинатных полимерных частицах была проведена в соответствии с методом, описанным в работе Laca [Laca et al., 2000]. Концентрация альгината в Ca-альгинатных полимерных частицах была равна 2, 5 % (w/w), а отношение объема частиц к объему занятой среды составило 20% (w/w).

Перед использованием все носители были помещены в автоклав на 20 мин при температуре 121 º С.

Грибная культура Trametes hirsutа (ВТ 2566) была выращена на картофельно-декстрозном агаре на чашках Петри при 30 º С в течение 10 дней. А затем поддерживалась при температуре 4º С до момента ее использования.

Далее процесс культивирования продолжили в колбах Эрленмейера. Состав культуральной среды соответствовал составу, приведенному в работе Abadulla [Abadulla et al., 2000], однако в нем отсутствовали отруби. В колбу Эрленмейера объемом 250 мл поместили 100 мл культуральной среды и 1, 8 г частиц вспененного полиуретана, 6 г нейлоновой губки или 4 г кусочков стальной губки, а также 3 кусочка картофельно-декстрозного агара диаметром 3 мм с активно растущей культурой гриба. Колбы были плотно закрыты марлевыми пробками, которые обеспечивали пассивную аэрацию, и помещены на качалку с частотой вращения 150 rpm при температуре 30º С на 7 суток.

Затем содержимое колб было перемещено в биореакторы объемом 180мл и 1л. Биореактор объемом 180мл представлял собой стеклянную колонну внутренним диаметром 4, 5 см и высотой 20см. Биореактор объемом 1л также представлял собой стеклянную колонну внутренним диаметром 8, 0 см и высотой 30 см. Состав культуральной среды соответствовал составу, приведенному в работе Abadulla [Abadulla et al., 2000], однако в нем отсутствовали отруби, содержание глюкозы соответствовало значению 3 г/л, а NH₄Cl – 0, 025г/л. Для стимулирования продуцирования лакказы в культуральную среду было добавлено 1мМ CuSO₄. Температура в биореакторах поддерживалась на уровне 30 º С с помощью циркуляции греющей воды. Воздух подавался в непрерывном режиме.

В качестве субстрата для спектрофотометрического определения активности лакказы был использован ABTS(2, 2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-sulphonate).

Результаты опытов показали, что при иммобилизации гриба на Ca-альгинатных шариках наиболее высокая активность лакказы была отмечена только в течение двух дней: на третий день (448 U/L) и на четвертый день(126U/L). Эффективность процесса иммобилизации оказалась невысокой, так как уже через несколько дней культивирования был отмечен переход клеток гриба из полимерной матрицы в культуральную жидкость.

При использовании частиц вспененного полиуретана в качестве носителя для иммобилизации гриба наибольшая активность лакказы (159U/L) была отмечена еще до заполнения биореактора, после чего она резко снизилась.

Активность лакказы гриба Trametes hirsuta, иммобилизованного на нейлоновых губках, оказалась очень низкой (24U/L) в период его культивирования в колбах Эрленмейера, имела свое максимальное значение на 6й день нахождения иммобилизованной культуры в биореакторе (494U/L), после чего резко снизилась.

Наибольшая активность лакказы была отмечена при иммобилизации грибной культуры на частицах стальной губки, которая составила 828 U/L на 8й день культивирования в биореакторе. Помимо этого в культуральной жидкости не было обнаружено клеток грибной культуры, что свидетельствует о высокой эффективности процесса иммобилизации на данном носителе.

Наибольший интерес вызывает использование в качестве носителя для иммобилизации грибов-продуцентов лакказы биодеградируемых носителей, таких как древесные стружки.

Так, Ehlers с соавторами в качестве носителей для иммобилизации грибов белой гнили использовали сосновые стружки и шарики из пеностекла (метод физической адсорбции) для биодеградации фенола и 2, 4, 6-трихлорфенола [Ehlers G.A. et al., 2004]. Процесс осуществлялся в плотно упакованных проточные биореакторах, установленных последовательно. В течение 24-30 часов концентрации фенола и 2, 4, 6-трихлорфенола в анализируемой водной среде снизились от исходных значений 800 и 85 мг/л соответственно более чем на 98%. Наибольшая активность лигнин пероксидазы 16.7-19 U/l была отмечена в биореакторе, где грибная культура была иммобилизована на шариках из пеностекла, в то время как в другом реакторе активность лигнин пероксидазы достигла значения лишь 0, 2-5 U/l.

Для очистки сточных вод от присутствующих в них красителей Susla с соавторами [Susla M. et al., 2006] в качестве носителя для иммобилизации грибной культуры Dichomitus squalens также использовали сосновую стружку. Процесс осуществлялся в лабораторном реакторе непрерывного действия рабочим объемом 0, 6 л. Иммобилизация грибной культуры обеспечила чрезвычайно высокий выход лакказы по сравнению с глубинной культурой. В результатеприменения иммобилизованного гриба Dichomitus squalens биодеградации подверглись антрахиноновый краситель Remazol Brilliant Blue R и азокраситель Reactive Orange 16.

В качестве носителя для иммобилизации гриба Phanerochaete chrysosporium также была предложена древесная стружка Итальянского тополя [Lu Y. et al., 2008]. Иммобилизация мицелия была проведена с целью его дальнейшего использования для биодеградации фенольных соединений коксовых сточных вод. В результате применения иммобилизованного мицелия гриба Phanerochaete chrysosporium содержание фенольных соединений в сточных водах снизилось на 87, 05% в течение 6 суток, что очевидно выше, чем при использовании неиммобилизованной глубинной культуры. Были определены оптимальные параметры процесса биодеградации фенольных соединений: pH 5, 0, температура 35 º С, при которых содержание фенольных компонентов снизилось на 84% в течение 3 суток.

Способность гриба Phanerochaete chrysosporium сорбировать ионы тяжелых металлов стала причиной использования его для очистки промышленных сточных вод от органических и неорганических загрязнителей [Iqbal M. et al., 2005]. Iqbal с соавторами оценили влияние иммобилизации мицелия гриба на прирост его биомассы для очистки сточных вод. В качестве носителя для иммобилизации мицелия гриба Phanerochaete chrysosporium были использованы дисковые губки из высушенного плода люфы. Данный носитель был выбран в связи с тем, что он является недорогим и легко утилизирумый, устойчив к механическим и химическим воздействиям, изменениям температуры и pH среды, а его структура обеспечивает свободный доступ водной среды к иммобилизованным клеткам гриба. Для сравнения прироста иммобилизованной и неиммобилизованной биомассы использовали колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие 0, 5 мл посевного материала, 100мл питательной среды. Для иммобилизации мицелия гриба в часть колб поместили по 4 дисковых губки люфы диаметром 2, 5см и толщиной 2-3мм, подвергнутых предварительной обработке. Колбы были помещены на качалку с частотой вращения 100 rpm при температуре 34º С на 8 суток. Затем иммобилизованная и неиммобилизованная биомасса была отфильтрована, промыта дистиллированной водой, высушена при температуре 70º С и взвешена с учетом веса дисковых губок. Прирост биомассы иммобилизованного гриба оказался на 21% больше прироста неиммобилизованной культуры, значение которого достигло 1900мг/л. Эффективность процесса иммобилизации грибной биомассы на дисковых губках была оценена путем помещения колб с биомассой, иммобилизованной на дисковых губках люфы, и дистиллированной водой на качалку с частотой вращения 150 rpm на 7 суток. При этом величина десорбции биомассы составила менее 1%.

Способность грибной биомассы сорбировать тяжелые металлы была рассмотрена на примере раствора, содержащего ионы Cd(II). Для этого было приготовлено два раствора с концентрацией ионов Cd(II) 50 и 200 мг/л. 100 мл каждого раствора было добавлено в колбы Эрленмейера, содержащие 100мг иммобилизованной или неиммобилизованной биомассы. Колбы поместили на качалку с частотой вращения 100 rpm на 120 мин при температуре 20±2º С. Сорбционная способность иммобилизованной биомассы при исходной концентрации ионов Cd(II) 50 мг/л составила 36, 8±0, 7 мг/г, для неиммобилизованной биомассы эта величина составила лишь 29, 7±0, 9 мг/г. В случае раствора с концентрацией ионов Cd(II) 200 мг/л сорбционная способность иммобилизованной биомассы составила 71, 3±1, 3 мг/г, для неиммобилизованной биомассы эта величина составила 59, 9±1, 5 мг/г.

В качестве модельного органического загрязнителя был выбран 4-хлоранизол, являющийся родственным соединением полихлорированных диоксинов и дибензофуранов, наиболее распространенных загрязнителей сточных вод. После 7 суток контактирования иммобилизованного мицелия гриба Phanerochaete chrysosporium с водными растворами 4-хлоранизола концентрацией 5, 10 и 20 мг/л содержание загрязнителя снизилось на 84%, 78% и 69% соответственно.

С целью очистки сточных вод целлюлозной промышленности от устойчивых загрязнителей Ortega-Clemente [Ortega-Clemente A. et al., 2008] с соавторами в качестве носителя для иммобилизации гриба Trametes versicolor использовали мелкую дубовую стружку. Обработку анаэробного слабо концентрированного черного щелочного раствора осуществляли в аэробном проточном биореакторе (с восходящим потоком) лабораторного масштаба, который был заполнен мицелием гриба Trametes versicolor, иммобилизованным на мелкой дубовой стружке. В аэробный биореактор сточные воды поступали из анаэробного биореактора с псевдоожиженным слоем.

В данной работе было протестировано два процесса с различным гидравлическим временем удерживания сточных вод. Первый процесс осуществлялся в течение 60 суток при гидравлическом времени удерживания сточных вод, равном 5 суток. Продолжительность другого процесса составила 35 суток при гидравлическом времени задержания сточных вод, равном 2, 5 суток.

Аэробный биореактор представлял собой стеклянную колонну геометрическим объемом 1, 5 л, наполовину заполненную частицами дубовой стружки размером 5 мм с иммобилизованным мицелием гриба Trametes versicolor. Температура в биореакторе поддерживалась на уровне 25 °С. Перед процессом очистки pH сточных вод было доведено до значения 4, 5. Никаких углеводов или дорогих растворимых углеродистых соединений добавлено не было.

Результатом проведения экспериментов стало снижения ХПК на 30% и 32% в биореакторе в течение 60 суток при гидравлическом времени удерживания, равном 5 суток, и в течение 35 суток при гидравлическом времени удерживания, равном 2, 5 суток, соответственно.

Интенсивность цвета и количество лигнин содержащих веществ в анализируемой жидкости при обоих значениях гидравлического времени удерживания сточных вод снизились на 69% и 54% соответственно. Ощутимой разницы между двумя режимами работы биореактора обнаружено не было, в связи с чем авторами был рекомендован режим с гидравлическим временем удерживания сточных вод, равным 2, 5 суток, что соответствует удвоенной пропускной способности биореактора.

Было обнаружено, что активность Mn-пероксидазы и лакказы поддерживалась на постоянном уровне в течение всего процесса обработки сточных вод, в то время как активность лигнин пероксидазы снизилась до минимального значения уже во втором периоде протекания процесса. При этом ферментативная активность в первом периоде протекания процесса была выше при гидравлическом времени удерживания сточных вод, равном 5 суток.

Таким образом,