Колориметрическим методом

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ

В ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ХЛОРОПЛАСТОВ

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

(реакция Хилла)

Объект: листья гороха посевного Pisum sativum L.

Цель: определить скорость потока электронов в электрон-транспортной цепи фотосинтеза по скорости восстановления искусственного акцептора электронов (K₃Fe(CN)₆) колориметрическим методом при:

а) базальном транспорте;

б) сопряжённом транспорте.

Ход работы:

ВЫДЕЛЕНИЕ ХЛОРОПЛАСТОВ

(ВНИМАНИЕ! Все процедуры выделения хлоропластов ведут при 0–5° С).

1. Получение гомогената.

Навеску листьев 4 г (предварительно охлажденных в холодильнике в течение 10–15 минут
в полиэтиленовом пакете или во влажной фильтровальной бумаге) растирают в фарфоровой ступке на льду в течение 1–2 минут с 25 мл среды выделения (0, 30 М NaCl в 0, 06М фосфатном буфере рН 8, 04). Полученный гомогенат фильтруют через капроновое полотно
в центрифужную пробирку.

2. Получение суспензии хлоропластов методом дифференциального центрифугирования.

Фильтрат в центрифужной пробирке уравновешивают другой центрифужной пробиркой
с водой. Проводят центрифугирование при 5000 об/мин в течение 2 минут. Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий хлоропласты, аккуратно размешивают кисточкой
в центрифужной пробирке с 25 мл среды выделения.

(ВНИМАНИЕ! Суспензию хлоропластов хранить в течение всех экспериментов в темноте на ледяной бане).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ

Варианты:

1, 2) Свет + АДФ (2 повторности) — сопряженный поток электронов

3, 4) Свет – АДФ (2 повторности) — базальный поток электронов

5) Темнота + АДФ — контроль

6) Темнота – АДФ — контроль

Опыты проводят в конических колбах небольшого объёма. В каждую колбу наливают реакционную смесь. Состав реакционной смеси (на 1 колбу):

Темновые варианты помещают в темноту на 7 мин, а световые освещают в течение 7 мин
на спец. установке. После выключения света во все варианты (и темновые, и световые) сразу добавляют по 1 мл 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота) и 2 мл 1М CH₃COONa для того, чтобы остановить реакцию. (!) После каждого добавления тщательно перемешивать.

Пробы фильтруют через двойные бумажные фильтры в стаканчики.

Оптическую плотность полученных фильтратов измеряют на ФЭКе при 400 нм. Контроль — вода (l_кюв.= 0, 5 см).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ

В мерную пробирку вносят 0, 5 мл суспензии хлоропластов, 1, 5 мл дистиллированной воды, 100%-ым ацетоном доводят объём до 10 мл. Раствор хорошо перемешивают и фильтруют
в коническую пробирку через стеклянный фильтр № 2 или № 3. Полученный фильтрат промеряют на спектрофотометре при длине волны 652 нм (контроль — 80% ацетон). Концентрацию хлорофилла в суспензии хлоропластов рассчитывают по формуле Арнона (Arnon, 1949):

c _Chl = 0, 58 * D₆₅₂ [мг _Chl /мл суспензии]

РАСЧЁТ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ В ЭТЦ ХЛОРОПЛАСТОВ

Количество (мкмоль) восстановленного K₃Fe(CN)₆ определяют по формуле:

(D₄₀₀ ^{темнота + АДФ} ― D₄₀₀ ^{свет + АДФ}) * V [мл]

ν = ————————————————— = [мкмоль K₃Fe(CN)₆] при сопряжённом транспорте

ε ₄₀₀ [л ммоль^-1 см^-1] * l [см]

(D₄₀₀ ^{темнота ― АДФ} ― D₄₀₀ ^{свет ― АДФ}) * V [мл]

ν = ————————————————— = [мкмоль K₃Fe(CN)₆] при базальном транспорте

ε ₄₀₀ [л ммоль^-1 см^-1] * l [см]

V = 8 мл — объём раствора

ε ₄₀₀ = 1, 04 л ммоль^-1 см^-1 — коэффициент милимолярной экстинкции K₃Fe(CN)₆ при λ = 400 нм;

l = 0, 5 см — длина оптического пути (= толщина кюветы)

мкмоль K₃Fe(CN)₆

Скорость потока электронов в ЭТЦ v_сопр. и v_баз. выражают в [—————————].

мг хлорофилла ∙ час

В выводах указать рассчитанные скорости сопряжённого (v _сопр.) и базального (v _баз.) транспорта электронов, соотношение скоростей v _сопр./ v _баз. Объяснить результаты на основе теоретических знаний о работе ЭТЦ.

Литература:

Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. — М.: Издательский центр " Академия", 2005 или 2007:

· электрон-транспортная цепь фотосинтеза — с. 163-179, 185-190;

· АТФ-синтаза — с. 95-99.