Порівняльна характеристика спадкової та неспадкової мінливості

Лекція №13

Тема: Сучасні і класичні уявлення про природу гена.

План.

1. Природа гена. Еволюція уявлень про ген. Класичне уявлення про ген як одиницю функції, рекомбінації і мутації. Сучасне уявлення про структурно-функціональну природу гена. Надлишковість ДНК. Повторення. Нестабільні генетичні елементи (інсерції і транспозони). Типи ДНК в клітині.

2. Реалізація генетичної інформації. Транскрипція. Процесінг і сплайсінг. Поняття про екзони і інтрони. Трансляція. Генетичний код і його властивості.

3. Регуляція активності генів. Регуляція транскрипції. Поняття оперону. Регуляція сплайсінгу і трансляції.

4. Генна інженерія – на самоопрацювання.

Поняття генетичної і генної інженерії. Основні операції генетичної інженерії. Способи синтезу і одержання генів. Зворотна транскриптаза (ревертаза). Ректриктази і лігази як знаряддя генної інженерії. Одержання рекомбінативних молекул ДНК. Вектори для перенесення генів і фрагментів ДНК. Генна інженерія і біотехнологія. Досягнення і перспективи генної інженерії.

Природа гена.

Генетична інформація геному складається з генів. Ген є елементарною структурно-функціональною одиницею спадковості, що визначає розвиток певної ознаки клітини або організму. Внаслідок передачі генів у ряді поколінь забезпечується успадкування ознак батьків.

Г. Мендель був першим, хто в 1865 р. стверджував про одиницю спадковості, він назвав її " спадковим фактором". Слово " ген" було введено В. Йогансеном у 1909 р. для позначення одиниці спадковості, що займає особливе місце (локус) у хромосомі. У 1948 р. Дж. Бідл і Е. Тейтем запропонували гіпотезу " один ген - один поліпептид" і розглядали ген як одиницю спадкового матеріалу, що містить інформацію для утворення одного білка.

Відповідно до сучасної концепції, ген — одиниця передачі спадкової інформації у вигляді безперервної ділянки ДНК, яка обумовлює певну функцію в організмі або забезпечує транскрипцію іншого гена. Отже, одна і та ж ДНК-послідовність може кодувати не один, а декілька різних поліпептидів.

Гени в ДНК розташовані у лінійному порядку. Кожен ген має своє місце розташування (локус). Теломерні та центромерні ділянки хромосом не містять генів.

Сукупність всіх одиниць інформації (генів), які містяться в клітині називають геномом, а сукупність генів даної клітини або організму складає його генотип.

Ген як одиниця генетичної інформації забезпечує такі функції:

• зберігання спадкової інформації;

• керування біосинтезом білків та інших сполук у клітині;

• редуплікації ДНК і РНК (подвоєння генів під час поділу);

• репарації (відновлення) пошкоджених ДНК і РНК;

• забезпечення спадкової мінливості клітин і організмів;

• контроль за індивідуальним розвитком клітин і організмів;

• явище рекомбінації.

У геномах еукаріотів спостерігається надлишковість ДНК, тобто незначна частина загальної послідовності геному (наприклад, 1, 5 % геному людини) кодує білки – тобто містить кодуючі гени (екзони), які чергуються з послідовностями, які не транслюються в амінокислотні послідовності (інтрони). Крім того, значна частина геному використовується для здійснення процесів ембріонального розвитку, диференціювання, росту і надалі не експресується.

Екзон — ділянка гена (ДНК) еукаріот, яка несе генетичну інформацію, що кодує синтез білка. Ділянки ДНК, які відповідають екзонам, на відміну від інтронів, повністю представлені в молекулі інформаційної РНК, що кодує первинну структуру білка.

Інтрон — ділянка гена (ДНК) еукаріот, яка, як правило, не несе генетичної інформації, що відповідає за синтез білка, кодованого даним геном. Інтрони розміщені між екзонами і представлені лише в первинному транскрипті — посередникові іРНК (про-іРНК), при дозріванні іРНК вони видаляються (а екзони залишаються).

Крім того, до некодуючих послідовностей ДНК також відносяться:

• промотори – гени, що безпосередньо передують відкритим рамкам зчитування;

• псевдогени — копії генів, інактивовані в результаті мутацій, які іноді можуть служити початковим матеріалом для дуплікації і подальшої дивергенції генів;

Залежно від організації нуклеотидів у ДНК, структури та функцій розрізняють такі типи нуклеотидних послідовностей:

1) структурні гени – несуть інформацію про структуру певних поліпептидів, із цих ділянок ДНК транскрибується іРНК, яка спрямовує синтез ферментів і структурних білків;

2) регуляторні гени (промотори, оператори) – контролюють і регулюють активність інших генів та процес біосинтезу білка;

3) сателітна ДНК – містить велику кількість повторюваних груп нуклеотидів, що не мають змісту і не транскрибуються, проте поодинокі гени серед сателітної ДНК, звичайно, мають регуляторну або посилювальну дію на структурні гени;

4) кластери генів – групи різних структурних генів у певній ділянці хромосоми, об'єднані загальними функціями;

5) спейсери – великі неінформативні ділянки ДНК, що знаходяться між кластерами, відокремлюють гени один від одного і не транскрибуються;

6) повторювані гени – один і той самий ген багаторазово повторюється (декілька сотень раз); не відокремлюючись один від одного, вони створюють тандеми.

Таким чином, гени – це ділянки кодуючої послідовності ДНК клітин разом із регуляторними ділянками.

З’ясовано, що гени еукаріотів є переривчастими, мозаїчними, вони складаються з кодуючих ділянок — екзонів, розділених некодуючими — інтронами.

Структурні гени — це кістяк геному, оскільки вони кодують структуру білків, визначають чергування амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюгу. Регуляторні гени виконують регуляторні функції і контролюють експресію (прояв) структурних генів.

Виявлені і так звані псевдогени, які не функціонують.

Поряд із стаціонарними генами, що локалізовані у певних ділянках хромосом, у геномах еукаріотів також містяться мобільні (нестабільні) генетичні елементи — послідовності ДНК, здатні переміщатися усередині геному живих організмів. Існує декілька класів мобільних елементів геному, що відрізняються за будовою і способом переміщення:

• транспозони – генетичні паразити і віруси або схожі на них послідовності. Можуть переміщатися в межах геному однієї клітини за допомогою процесу транспозиції забезпечують переміщення невеликих ділянок генетичного матеріалу (транспозонів) у межах однієї хромосоми чи між різними хромосомами. в результаті чого можуть викликати мутації і змінювати кількість ДНК в геномі. Транспозони також відомі під назвою «стрибаючі гени» й іноді виступають в якості гомологічних ділянок при гомологічній рекомбінації;

• інсерції – короткі ділянки ДНК, що кодують лише білки, залучені в процес транспозиції (на відміну від транспозонів, що зазвичай несуть допоміжні гени, наприклад гени резистентності);

• профаги — латентна форма помірних бактеріофагів;

• плазміди.

Хоча мобільні елементи в цілому є «генетичними паразитами», вони є важливим механізмом мінливості і обміну генетичним матеріалом між організмами як одного виду, так і різних видів.

Реалізація генетичної інформації.

У генах закодована інформація, яка необхідна для синтезу амінокислотної послідовності білків. Фраза «закодувати» досить часто уживається, щоб позначити інформацію, яка міститься у генах, і необхідна для певної структури білка: «гени кодують білки». Гени також кодують нуклеотидну послідовність різних типів РНК, найважливішими з яких є інформаційні, або матричні (іРНК, або мРНК), рибосомальні (рРНК) і транспортні (тРНК). За допомогою цих трьох різновидів РНК відбувається синтез білків, які здійснюють метаболізм і зумовлюють розвиток ознак.

ДНК є носієм генетичної інформації, записаної у вигляді нуклеотидної послідовності за допомогою генетичного коду, який складається із тринуклеотидних послідовностей (триплетів нуклеотидів або кодонів). М.Гамов ще в 1954 р. припустив, що кодування інформації в ДНК може здійснюватися сполученням декількох нуклеотидів. Одне з визначних досягнень біології XX століття - розшифрування триплетного генетичного коду. Антикодон складається з п'яти нуклеотидів, у центрі - три специфічних рибонуклеотиди (триплет). Азотисті основи антикодона мають комплементарний триплет (кодон) на ланцюгу іРНК. У період синтезу білка антикодон знаходить відповідний йому кодон на іРНК і тимчасово приєднується до нього водневими зв'язками.

Таким чином, генетичний код - є системою кодування послідовності амінокислот у молекулі білка у вигляді певної послідовності триплетів нуклеотидів у молекулі ДНК і РНК.

Чотири азотистих основи в комбінаціях по 3, тобто 43, можуть утворити 64 різних кодони. Серед 64 кодонів три є сигналами зупинки синтезу білка (стоп-кодони, або нонсенс-кодони), решта (61 змістовний кодон) відповідають 20 амінокислотам.

Оскільки можливих варіантів кодонів 64, амінокислот - 20, із яких 18 амінокислот кодуються кількома синонімічними триплетами (кодонами-синонімами) і тільки дві амінокислоти – триптофан і метіонін – кодуються лише одним кодоном кожна.

Генетичний код ДНК має такі фундаментальні характеристики:

1) триплетність (триплет нуклеотидів – це три сусідні азотисті основи, які кодують одну амінокислоту);

2) специфічність (кожен окремий триплет кодує тільки одну певну амінокислоту);

3) неперекривність (жодна азотиста основа одного кодону ніколи не входить до складу іншого кодону);

4) відсутність розділових знаків (генетичний код не має " знаків пунктуації" між кодуючими триплетами у структурних генах);

5) універсальність (генетичний код однаковий для всіх живих організмів, від бактерій до ссавців, тобто у всіх живих організмів той самий триплет кодує ту ж амінокислоту);

6) надмірність або виродженість (деякі амінокислоти часто кодуються більш ніж одним кодовим триплетом);

7) колінеарність (ДНК є лінійним полінуклеотидом, а білок – лінійним поліпептидом. Послідовність амінокислот у білку відповідає послідовності триплетів у його гені. Тому ген і поліпептид, який він кодує, називають колінеарними);

8) відповідність (гени – поліпептиди).

Всі ці типи РНК синтезуються на матриці ДНК (тобто за рахунок копіювання послідовності ДНК у послідовність макромолекули, що синтезується) у процесі транскрипції і беруть участь у біосинтезі білків (процесах сплайсингу і трансляції).

Генетична інформація, закодована в ДНК, зчитується при експресії генів. У більшості випадків вона використовується для біосинтезу білків у процесах транскрипції (синтезу молекул РНК на матриці ДНК) і трансляції (синтезу білків на матриці РНК).

Під час транскрипції відбувається зчитування генетичної інформації, зашифрованої в молекулах ДНК, і запис цієї інформації в молекули іРНК.

Після транскрипції під час процесінгу (молекулярний механізм " дозрівання", тобто формування зрілих іРНК з попередника) здійснюється сплайсинг — процес вирізування із іРНК некодуючих послідовностей (інтронів) та зшивання кодуючих послідовностей (екзонів). Тому послідовність нуклеотидів у дозрілої іРНК не є цілком комплементарною нуклеотидам ДНК. Зріла молекула іРНК стає значно коротшою (майже в 10 разів у порівнянні з первинним транскриптом), виходить у цитоплазму і бере участь у синтезі білка.

Внаслідок того, що в геномах прокаріотів інтрони трапляються дуже рідко (знайдені лише в генах тРНК і рРНК), сплайсінг зазвичай характерний для еукаріотів. У багатьох випадках, сплайсінг призводить до утворення кількох унікальних типів білків, залежно від того, які інтрони вилучаються і які екзони об'єднуються — це явище називається альтернативним сплайсінгом.

Транскрипція і процесинг відбуваються в ядрі клітини. Потім зріла і-РНК через пори в мембрані ядра виходить в цитоплазму, і починається трансляція. З'єднання амінокислот з утворенням білка відбувається на рибосомах. Процес синтезу білків (трансляція), як реплікація і транскрипція, умовно поділяється на такі етапи:

• ініціація – активація амінокислот за допомогою специфічних ферментів білкової природи;

• елонгація - подовження поліпептидного ланцюга;

• термінація – закінчення синтезу та вивільнення поліпептидного ланцюга.

Перший етап трансляції пов'язаний з функціонуванням транспортної РНК (т-РНК). Число різновидів молекул т-РНК дорівнює числу основних амінокислот, тобто їх 20 видів. Кожній амінокислоті відповідає певна т-РНК і певний фермент.

У цитоплазмі клітини завжди в достатній кількості є різні амінокислоти. З них молекула т-РНК відбирає відповідну амінокислоту. Кожна амінокислота, перш ніж вступити в білковий ланцюг, за допомогою спеціального ферменту з'єднується з АТФ і запасається енергією. Потім амінокислота зв'язується з т-РНК, яка переносить її до рибосом. Характерною рисою молекул т-РНК є наявність в їх структурах антикодонів, що забезпечується розташуванням відповідних амінокислот в тій послідовності кодонів, яка зашифрована в молекулі і-РНК. Між поряд розташованими амінокислотами виникають пептидні зв'язки і синтезується молекула білка.

На останній стадії посттрансляційної модифікації відбуваються зміни новосинтезованого білка додаванням небілкових молекул та ковалентними модифікаціями його амінокислот. Внаслідок цього білки набувають специфічних властивостей і функціональної активності.

Таким чином, генетична інформація, закодована в ДНК, реалізується різними видами РНК в молекулах відповідних білків.

Регуляція активності генів.

Відомо, що гени не проявляють постійної активності. Ген перебуває в неактивному стані, але коли є необхідність, він активується, і це зумовлює синтез відповідного білка. Таким чином, клітинам властивий механізм, що контролює кількість будь-якого ферменту в певний проміжок часу. Синтез білків регулюється генетичним апаратом і факторами внутрішнього і зовнішнього середовища.

Функціональна нерівнозначність клітин і пов'язана з нею репресія й активація генів давно привертали увагу генетиків. Перша спроба пояснити регуляторну активність генів були зв'язані з вивченням білків-гістонів. Ще чоловік і дружина Стедман на початку 40-х років нашого століття одержали перші чіткі результати про розходження в хімічній природі білків-гістонів. Подальші дослідження показали, що регуляція генної активності є більш складним процесом, ніж проста взаємодія ділянок генів з молекулами білків-гістонів.

У 1961 р. французькі біологи Ф.Жакоб і Ж.Моно запропонували механізм регуляції генів, який було названо гіпотезою оперона. Згідно цієї теорії регульована одиниця транскрипції (оперон) складається з наступних структурних частин:

• Структурні гени - ділянки ДНК, які кодують іРНК конкретних білків.

• Ген-регулятор - контролює утворення білка-репресора, за допомогою якого керує функціонуванням структурних генів.

• Промотор - ділянка ДНК, до якої приєднується РНК-полімераза і з якої розпочинається транскрипція. У цій ділянці відбувається взаємне розпізнавання унікальної послідовності нуклеотидов у ДНК і специфічній конфігурації білка РНК-полімерази. Від ефективності розпізнавання залежить здійснення процесу зчитування генетичної інформації з даної послідовності генів оперона, що примикає до промотору.

• Оператор - ділянка промотора, яка вмикається або вимикається білком-репресором. Репресор або зв'язується з оператором і пригнічує його активність, або не зв'язується з ним і дозволяє виявляти активність структурним генам. Таким чином, репресор є негативним регулятором. Геном-оператор безпосередньо зчеплений з групою структурних генів.

• Термінатор – ділянка ДНК, яка несе сигнал про зупинку транскрипції.

Усі названі елементи функціонування генів входять до складу оперона.

Отже, оперон - це послідовність спеціальних функціональних сегментів ДНК та структурних генів, які кодують синтез певної групи білків одного метаболічного ланцюга. Оперон служить одиницею транскрипції, тобто з нього списується одна молекула і-РНК.

Регуляція експресії всіх генів відбувається на різних рівнях:

1. Регуляція на генному рівні відбувається шляхом

- модифікації ДНК (наприклад, заміна цитозіна або гуаніна на метіл-цитозін або метіл-гуанін; метилювання азотистих основ знижує активність генів);

- більшення об'єму ДНК шляхом диференціальної ампліфікації ДНК (наприклад, багатократне копіювання генів рРНК) або за рахунок утворення політенних хромосом;

- програмовані кількісні зміни ДНК (наприклад, зміна орієнтації промотора);

- сплайсинг ДНК (наприклад, вирізування ділянок генів, що кодують антитіла);

- димінуція хроматину – необоротна втрата частини генетичного матеріалу в соматичних клітинах деяких організмів (інфузорій, аскарид, циклопів);

- зміна активності цілих хромосом (наприклад, інактивация однієї з двох X–хромосом у самок ссавців);

- зміна послідовностей ДНК за допомогою рухомих генетичних елементів, наприклад, транспозонов.

2. Регуляція на рівні транскрипції – шляхом регуляції транскрипції мРНК. Інтенсивне функціонування окремих генів або їх блоків відповідає певним етапам розвитку і диференціювання. Регуляторами транскрипції у тварин часто є стероїдні гормони.

3. Регуляція на рівні сплайcінга (модифікації посттрансляції мРНК) – забезпечує можливість утворення різних типів зрілої, функціонально активної мРНК. Процесінг РНК регулюється за допомогою рібозімов (каталізаторів рібонуклеїнової природи) і ферментів матураз. Деякі генетичні захворювання людини (фенілкетонурія, деякі гемоглобінопатії) обумовлені порушенням сплайсинга.

4. Регуляція на рівні трансляції – обумовлена різною активністю різних типів мРНК.

5. Регуляція на рівні модифікації посттрансляції білків – регулюється шляхом модифікації посттрансляції білків (фосфорилюванням, ацетилюванням, розщеплюванням початкового поліпептідного ланцюга на дрібніші фрагменти тощо).

Розглянуті приклади свідчать про різноманіття способів реалізації генетичної інформації шляхом регуляції активності самих генів або їх продуктів.

На самоопрацювання.

Генна інженерія — це біотехнологічний прийом спрямованого конструювання рекомбінантних молекул ДНК на основі ДНК, взятої з різних джерел.

Сучасні біологія і біохімія інтенсивно використовують методи, засновані на рекомбінантній ДНК. Рекомбінантна ДНК — штучно створена людиною послідовність ДНК, частини якої можуть бути синтезовані хімічним шляхом або клоновані з ДНК різних організмів. Рекомбінантні ДНК можуть бути трансформовані в клітини живих організмів у складі плазмід або вірусних векторів. Генетично модифіковані тварини і рослини зазвичай містять рекомбінантні гени, вбудовані в їхні хромосоми. Тоді як генетично модифіковані бактерії і дріжджі використовуються для виробництва рекомбінантних білків, тварини використовуються в медичних дослідженнях, а рослини з покращеними харчовими якостями — в сільському господарстві.

Генна інженерія ґрунтується на методах молекулярної біології, які дають можливість вносити зміни в молекулярну взаємодію основних біологічних молекул у клітині й поза нею.

Слід зазначити, що чіткої різниці між молекулярною біологією і генною інженерією немає. Пояснюється це тим, що біотехнологія (в даному випадку генна інженерія) використовує методи, розроблені молекулярною біологією.

Вивчення загальних біохімічних властивостей клітинної ДНК не давало можливості визначити особливості її генетичної структури. Вирішенню цього питання сприяли два методи молекулярної біології. Перший метод — відкриття гідролітичних ферментів (рестриктаз, рестрикційних ендонуклеаз), які в певних місцях розщеплюють ДНК на фрагменти, що мають специфічну нуклеотидну послідовність молекули ДНК. Рестриктази одержують з бактеріальних клітин.

Ферменти рестриктаз гідролізують нуклеотидні послідовності, в результаті чого отримують від кількох сотень до кількох тисяч і більше пар фрагментів ДНК, які різняться за молекулярною масою. Фрагменти виділяють в ізольованому вигляді за допомогою електрофорезу в гелі, а потім аналізують.

Другим методичним прийомом є визначення нуклеотидної послідовності фрагментів ДНК, які одержують за допомогою рестриктаз у макромолекулі ДНК (автори методу – Ф.Сенгер і А.Коулсон, 1975 р.).

У молекулярній біології також розроблено методи виділення генів донорських організмів, введення їх у векторну молекулу і одержання гібридних (рекомбінантних) ДНК, забезпечення їхнього самовідтворення (реплікації), переносу в організм реципієнта (клітину-господаря) і забезпечення експресії чужих генів.

Для перенесення генів, яких немає в клітині-реципієнті, використовують переносники генів (вектори) — плазміди (епісоми). За рахунок реплікації кількість копій плазмід регулярно збільшується і вони рівномірно розподіляються між нащадками клітини, яка ділиться.

Рекомбінантні молекули ДНК використовуються і будуть використовуватися в роботі з мікроорганізмами для виробництва різних цінних речовин у медицині, біохімічній промисловості, сільському господарстві. Велике значення при цьому має метод клонування генів.

Технологія конструювання рекомбінантних ДНК є одним з найважливіших досягнень біотехнології. Стосовно рослинництва вона має велике майбутнє у створенні сортів і гібридів з корисними біологічними та екологічними властивостями. Це — високі врожайність і якість врожаю, стійкість проти хвороб, шкідників, бур'янів, здатність до активної азотфіксації, одночасність дозрівання, посухостійкість, високий коефіцієнт засвоєння ФАР (висока продуктивність) та ін.

Порівняно з традиційною селекцією, основними інструментами якої є схрещування і відбір, генна інженерія дає можливість використання принципово нових генів, які визначають агрономічно важливі ознаки, і нових молекулярно-генетичних методів моніторингу трансгенів (молекулярні маркери генів), що в багато разів прискорюють процес створення трансгенних рослин. Важливим направленням є створення генетично модифікованих рослин (ГМР) з ознакою чоловічої стерильності. Крім того, завдяки генетичній модифікації рослини можуть виконувати не властиву їм раніше функцію. Прикладом є коренеплоди цукрових буряків, які накопичують замість сахарози низькомолекулярні фруктози. Вирощування ГМР, стійких до широкого спектру хвороб та комах-шкідників, може суттєво знизити, а в подальшому звести до мінімуму пестицидне навантаження на оточуюче середовище.