Образование супероксидного анион-радикала в митохондриях

У большинства эукариотических организмов аэробный синтез энергии осуществляется в митохондриях. На внутренней мембране митохондрий локализована группа ферментов и белков, образующих митохондриальную дыхательную цепь, по которой происходит транспорт электронов от доноров-кофакторов (НАДН, ФАДН₂) к молекулярному кислороду с образованием АТФ. Количество митохондрий в разных клетках варьирует от нескольких органелл до тысяч. Наибольшее их количество в пересчете на грамм ткани млекопитающих выявляется в миокарде, тканях мозга, печени, мышцах. В нормальных условиях при окислительном фосфорилировании в митохондриях менее 5 % кислорода преобразуется в АКМ - О₂ ^., который метаболизируется марганцевой изоформой СОД, в результате чего его концентрация поддерживается на низком уровне (10^-11М). Однако генерация О₂ ^. и других АФК в митохондриях может существенно возрастать при нарушении электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), что наблюдается при ишемии реперфузии, избытке Са²⁺, действии ряда соединений. Установлено, что скорость образования О₂ ^. и Н₂О₂ митохондриями разных видов насекомых, птиц, млекопитающих (мышь, крыса, морская свинка, кролик, свинья, корова) обратно пропорциональны средней продолжительности жизни их представителей.

Митохондрии содержат девять сайтов, способных продуцировать Супероксидный анион-радикал, но наиболее эффективными участками генерации О₂ ^. являются комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) и комплекс III (убихинол-цитохром с-редуктаза) электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Рассмотрим некоторые из известных сайтов генерации О₂ ^. в митохондриях.

1. Редуктаза цитохрома b₅ расположена во внешней мембране и экспрессируется во многих тканях млекопитающих. Этот фермент окисляет цитоплазматический НАДН цитохромом b₅ внешней мембраны, а также может восстанавливать радикал аскорбата. Митохондриальная редуктаза цитохрома b₅ может довольно эффективно генерировать О₂ ^., со скоростью 300 нмоль/мин/мг белка.

Активность редуктазы b₅ значительно увеличена в тканях больных шизофренией, указывая на ее возможную роль в этиологии этого заболевания.

2. Моноаминооксидазы А и Б (МАО-А, МАО-Б) расположены во внешней мембране митохондрий и катализируют окисление различных биогенных аминов, что сопровождается продукцией О₂ ^. и Н₂О₂. МАО-А и МАО-Б могут быть основным источником перекиси водорода в тканях при ишемии, старении, окислении экзогенных аминов. Предполагают, что значительное возрастание моноаминооксидаз и соответствующее этому увеличение продукции О₂ ^. и Н₂О₂ является существенным фактором повреждения митохондрий при болезни Паркинсона.

3. Дегидрогеназа альфа-глицерофосфата (мтГФДГ) распоположена на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. В тканях мышей наибольшая активность мтГФДГ обнаружена в буром жире, скелетных мышцах и тканях мозга. Фермент содержит флавины (ФАД) и катализирует окисление альфа-глицерофосфата до дигидрооксиацетонфосфата, используя убихинон в качестве акцептора электронов. Эта реакция участвует в метабодлизме липидов и челночном механизме окисления цитозольного НАДН в митохондриях, что регенерирует НАД⁺ для реакций гликолиза. Экспрессия мтГФДГ значительно возрастает при гипертироидизме. Было установлено, что митохондрии мыши и мухи дрозофилы генерируют О₂ ^. и Н₂О₂ при окислении альфа-глицерофосфата.

4. Сукцинатдегидрогеназа (комплекс II, СДГ) – флавин-содержащий белковый комплекс, локализованный во внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий. СДГ окисляет янтарную кислоту (сукцинат) до фумаровой с использованием убихинона в качестве акцептора электронов. Полагают, что СДГ способна генерировать АФК путем окисления ФАДН₂ фермента кислородом, что может быть вызвано недостатком убихинона, естественного акцептора электронов для СДГ.

Как уже указывалось, важнейшие источники супероксида в митохондриях находятся в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) – это комплексы I и III. В митохондриях образование доноров электронов (НАДН, сукцината и др.) дает начало переносу электронов во внутренней мембране от НАДН и сукцината к кислороду, сопряженному с транслокацией протонов. Известно около 20 переносчиков электронов, составляющих ЭТЦ митохондрий; это основные элементы структуры митохондрий, на которые приходится около 25 % белка митохондриальных мембран. Среди переносчиков только НАД, флавины и убихинон являются двухэлектронными, в то время как остальные компоненты ЭТЦ – одноэлектронные. Как правило, в ЭТЦ переносчики электронов расположены в последовательности, при которой их редокс-потенциалы возрастают от -0, 32В (НАДФН) до +0, 82В (О₂). Эта разность окислительно-восстановительных потенциалов, составляющая 1, 14В, и есть движущая сила, которая приводит к синтезу АТФ.

Рис. 6. Электрон-транспортная цепь митохондрий

5. Комплекс I (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза) является первым звеном окислительного фосфорилирования в митохондриях, у млекопитающих он включает 43 полипептида общей молекулярной массой около 900 кДа. В состав комплекса НАДН-дегидрогеназы входят два флавиновых мононуклеотида, семь железо-серных кластеров и несколько КоQ-связывающих белков. Комплекс I расположен во внутренней мембране митохондрий так, что он доступен как со стороны матрикса, так и из межмембранного пространства. Комплекс I катализирует окисление НАДН матрикса убихиноном внутренней мембраны. Эта реакция обратима и сопряжена с трансмембранным переносом протонов, который генерирует электрохимический потенциал протонов mн⁺. Комплекс I является одним из двух основных порталов, посредством которых восстановительные эквиваленты, полученные в цикле Кребса, поступают в дыхательную цепь (другой портал – СДГ). Предполагается, что АФК-генерирующими центрами в комплексе I могут быть флавин или его комплекс с радикалом НАД, а также железосерные центры комплекса.

6. Комплекс III (убихинон: цитохром с редуктаза) митохондриальной дыхательной цепи катализирует окисление убихинола (QH₂) во внутренней мембране митохондрий, используя цитиохром с как акцептор электронов. Окисление QH₂ осуществляется в ряде взаимосвязанных реакций, известном как Q-цикл, и сопряженном с векторным переносом протонов и генерацией mн⁺. Комплекс III может генерировать значительные количества супероксида, который затем быстро дисмутирует до Н₂О₂. В настоящее время общепринято, что источником супероксида в комплексе III является нестабильный радикал семихинона (QH^.). Формирование супероксида в комплексе III было прямо показано в 1980 году А.А. Константиновым и его коллегами из лаборатории В.П. Скулачева.

Существование цикла убихинона или коэнзима Q (CoQ) в качестве протон-транспортного механизма было предложено в 1975 году Питером Митчеллом. В основе функционирования такого цикла лежит способность убихинона окисляться и восстанавливаться (CoQН₂«CoQ) с высвобождением или поглощением двух протонов и электронов. На внутренней мембране митохондрий со стороны матрикса CoQ восстанавливается до CoQН₂, мигрирует на другую сторону мембраны и выводит протоны в межмембранное пространство, а электроны поступают в электрон-транспортную цепь на цитохромы с₁ и с. Одноэлектронное окисление CoQН₂ или восстановление CoQ сопровождается образованием реакционных убисемихинонных радикалов (CoQН^.). Окисляясь и восстанавливаясь в ходе транспорта электронов, убихинон может восстанавливать молекулярный кислород с образованием О₂ ^.:

CoQН₂ + О₂ → CoQН^. + О₂ ^.

CoQН^. + О₂ → CoQ + Н⁺ + О₂ ^.

При этом в восстановленном состоянии убихинон может ингибировать супероксид, восстанавливая его до Н₂О₂, также как и другие органические радикалы:

О₂ ^. + CoQН₂ → Н₂О₂ + О₂ + CoQ + 2 е^-

2ROO^. + CoQН₂ → 2ROOH + CoQ

Таким образом, в митохондриях CoQ является как основным прооксидантом, так и главным антиоксидантом.

Важным источником О₂ ^. в митохондриях может служить цитохром b₅₆₆, входящий в комплекс III. Цитохром b₅₆₆ в митохондриях может иметь высокий (+245 мв) или низкий (-30 мв) редокс-потенциал в зависимости от того, энергизованы митохондрии или нет, т.е. существует или нет разность электрохимического потенциала протонов между матриксом и межмембранным пространством.

В деэнергизованных митохондриях Е_о¹ = -30 мв и в этих условиях цитохром b₅₆₆ обладает высокой восстановительной способностью, в результате чего протекает следующая реакция:

Цитохром b₅₆₆ (Fe²⁺) + O₂ → цитохром b₅₆₆ (Fe³⁺) + О₂ ^.

Таким образом, взаимодействие деэнергизованных митохондрий с кислородом приводит к генерации супероксида, что наблюдается при гипоксии (реоксигенации и ишемии/реперфузии).

Установлено, что относительный вклад в продукцию О₂ ^. как самих митохондрий, так и компонентов дыхательной цепи значительно отличается для разных органов. Предполагается, что комплекс I является основным продуцентом супероксида в митохондриях мозга, печени и скелетных мышцах, тогда как комплекс III отвечает за образование О₂ ^. в митохондриях сердца и легких. Среди фагоцитирующих клеток (перитонеальные и альвеолярные макрофаги, моноциты, гранулоциты) главными источниками супероксида являются митохондрии альвеолярных макрофагов.

Супроксидный анион-радикал, образующийся в ЭТЦ митохондрий, может активировать белки, разобщающие окисление и фосфорилирование. Разобщающие белки (РБ) принадлежат к семейству митохондриальных переносчиков, локализованные на внутренней мембране. Выявлены различные формы РБ, так РБ₁ содержится в митохондриях из бурого жира, РБ₂ представлен во многих тканях, в скелетных мышцах доминирует РБ₃, а в головном мозге – РБ₄ и РБ₅. Считается, что основное предназначение этих белков – терморегуляция, но они могут выполнять и другие функции. РБ₁, локализованный в митохондриях бурого жира и названный термогенин, является классическим митохондриальным разобщающим белком, он активируется при повышении уровня жирных кислот и индукции ПОЛ.

Таким образом, синтез О₂ ^. и Н₂О₂ в ЭТЦ митохондрий может приводить к активации разобщающих белков, снижению mн⁺ и тем самым может способствовать уменьшению продукции АКМ в условиях высокого содержания восстановителей.

Высокая продукция АКМ может вызвать повреждение митохондрий, индуцировать митоптоз, а также служить причиной клеточного апоптоза.

Продукция О₂ ^. и апоптоз

Апоптозом выбраковываются клетки, зараженные вирусами, а также клетки, ставшие источниками цитотоксических продуктов одноэлектронного восстановления кислорода, т.е. АФК. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, - это процесс клеточной элиминации, обеспечивающий развитие многоклеточного организма в ходе метаморфоза, эмбрио- и морфогенеза, у взрослых особей апоптоз направлен на поддержание гомеостаза за счет удаления клеток, утративших свои функции и клеток, представляющих потенциальную опасность для организма. В 1994 году В.П. Скулачевым было высказано предположение, что аэробная клетка располагает эшелонированной системой защиты от кислорода путем предотвращения образования АФК. Эта система работает в митохондриях наряду с антиоксидантными механизмами и включает три основных этапа действия.

1. «Мягкое» разобщение окисления и фосфорилирования путем повышения протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий. Это явление наблюдается в покое, когда фосфорилирование тормозится из-за недостатка АДФ, что приводит к повышению концентрации кислорода, увеличивает время жизни убисемихинона (CoQH^.) и ускоряет генерацию О₂ ^. . Далее разобщение ускоряет потребление кислорода, уменьшает время жизни убисемихинона и образование О₂ ^. .

2. Полное разобщение дыхания и фосфорилирования вследствие открытия пор во внутренней мембране митохондрий. При этом скорость потребления кислорода дыхательной цепью достигает максимума, что приводит к снижению концентрации кислорода в клетке, а время жизни убисемихинона минимально.

Открытие пор провоцируется ростом концентрации О₂ ^. и других АФК. С другой стороны, поры являются механизмом элиминации митохондрий, которые накапливают супероксид.

3. Апоптоз, индуцированный митохондриями. Длительное открытие пор во внутренней мембране митохондрий приводит к набуханию митохондрий, разрыву внешней мембраны, освобождение белка «самоубийства» (Apoptose inducible factor, AIF), запуск апоптоза и элиминация клеток, образующих О₂ ^. . Таким образом, порообразование – это сигнал к апоптозу.

Рис. 7. Роль митохондрий в индукции апоптоза

В 1996 году Гвидо Кремер с сотрудниками описали механизм участия митохондрий и роль митохондриальных пор в апоптозе. При разрыве внешней мембраны митохондрий выходит AIF, который локализован в межмембранном пространстве. AIF – это флавопротеин, который переносится из митохондрий в ядро, где участвует в разрезании ДНК на крупные фрагменты и периферической конденсации хроматина. AIF содержит N-концевой ФАД-связывающий и центральный НАДН-связывающий домены, обладает оксидоредуктазной активностью. Считают, что в зависимости от своей локализации в клетке AIF может иметь различные функции:

- в митохондриях он служит ловушкой АФК и способствует выживанию клетки;

- в цитоплазме может вызывать накопление АФК;

- в ядре участвует во фрагментации ДНК.

Наряду с белком «самоубийства» AIF через поры в мембранах митохондрий в цитоплазму может выходить цитохром с, который участвует в образовании апоптосомы и запуске апоптоза.

В настоящее время высказывается предположение, что уровень продукции АФК в митохондриях определяет темп жизни, скорость старения и стратегию эволюционного развития. Так, предполагают, что одной из причин большей продолжительности женщин по сравнению с мужчинами является относительно низкий уровень О₂ ^. и Н₂О₂ и более высокое содержание глутатиона, глутатионпероксидазы и Mn-СОД в митохондриях.