Подготовительные работы при исследовании материала в ИФА

Накануне тестирования исследуемого материала.

1. Приготовление раствора МкАт для сенсибилизации планшетов (раствор 1) в разведении 1: 50.

Готовят 30 мл физиологического раствора 0, 85%-ной концентрации pH 7, 2, вскрывают ампулу с МкАт и вносят в нее 0, 6 мл приготовленного физиологического раствора. Затем содержимое ампулы переносят в оставшееся количество физиологического раствора (24, 9 мл), тщательно перемешивают.

2. Сенсибилизация планшетов (адсорбция МкАт на планшеты).

Во все лунки планшетов (из набора) вносят по 0, 1 мл (100 мкл) раствора 1. Планшеты накрывают крышками, выдерживают в течение 2 часов в термостате при 37⁰ С, затем переносят планшеты на 18-24 часа в холодильник (4⁰ С). При необходимости сенсибилизированные планшеты могут храниться в течение 2 недель при температуре 4⁰ С.

3. Подготовка исследуемого материала и положительного контроля.

Тампоны при исследовании носоглотки или других мест локализации патологического процесса; микроорганизмы в объеме 1 бактериологической петли диаметром 1, 5 мм; 1-3 колонии с чашки первичного роста засевают в жидкую питательную среду (см. раздел «Питательные среды»).

Качество жидкой питательной среды проверяют культивированием контрольного (референс) токсигенного штамма коринебактерии дифтерии варианта gravis, который засевают в жидкую питательную среду в объеме 1 бактериологической петли диаметром 1, 5 мм.

Пробирки с исследуемым материалом и контрольным штаммом выдерживают в термостате в течение 18 часов при 37⁰ С (при необходимости исследования материала можно провести после 5-часового инкубирования в термостате).

В день постановки опыта готовят рабочие разведения всех компонентов реакции.

1. Приготовление промывающего раствора 2.

Используют 0, 05% раствор твина-20, для чего содержимое флакона «Твин-20» полностью переносят в 2 л 0, 85% раствора хлорида натрия pH 7, 2, тщательно перемешивают (образуется пена). Раствор используют для промывания планшетов, разведения исследуемых проб, коъюгата, положительного контроля. Раствор можно хранить при 4⁰ С до 2-х недель.

2. Приготовление рабочего разведения положительного контроля (дифтерийного анатоксина) - раствор 3.

Контроль вводится для оценки чувствительности тест системы. Используют рабочее разведение анатоксина 1: 4000, которое готовят методом последовательных разведений. Разведение 1: 40 - в ампулу, содержащую 0, 05 мл анатоксина, вносят 1, 95 мл раствора 2, тщательно перемешивают (хранят при 4⁰ С до 2-х недель). Затем готовят разведение 1: 400 - 0, 1 мл анатоксина в разведении 1: 40 вносят в 0, 9 мл раствора 2, тщательно перемешивают; разведение 1: 4000 - 0, 1 мл анатоксина в разведении 1: 400 вносят в 0, 9 мл раствора 2, тщательно перемешивают (содержит 0, 075 Lf/мл).

3. Рабочие разведения конъюгата, 5-АС и субстратной смеси готовятся непосредственно перед внесением в лунки планшетов (см. раздел «Постановка ИФА»).