Імунобіологічні препарати та допоміжні матеріали

Якість поживних середовищ є важливою умовою при бактеріологічному дослідженні. Щоб отримати максимальну прорість та висіваність коринебактерій з матеріалу, що досліджу­ється, необхідно створити оптимальні умови для росту та розмноження цих бактерій, збереження їх біологічних властивостей та умов для інгібіції супутньої мікрофлори. Це досягається шляхом використання універсальних поживних середовищ з доданням крові та телуриту калію. Телурит калію не перешкоджає росту коринебактерій і практично повністю інгібує ріст побічної мікрофлори. Коринебактерії здатні відновлювати телурит калію до металічного телуру (речовина чорного кольору) та накопичувати його всередині клітин. Тому на кров'яно-телуритових середовищах, які є також диференційно-діагностичними, колонії коринебактерій набувають сірого або чорного кольору.

В даний час, як основу для поживних середовищ, використовують поживні агари (СПА, еритрит-агар, АГВ).

Якщо ростові властивості поживного середовища не задовольняють вимог, агарові основи готують на бульйонах (СПБ, комерційний або виготовлений в лабораторних умовах, перевар Хоттінгера, 1% пептонна вода з вмістом амінного азоту 150-180 мг %).

Крім зазначених, для первинного посіву можна застосовувати комерційне середовище " Коринебакагар", яке не потребує додавання крові.

Для визначення токсигенних властивостей коринебактерій дифтерії випускається комерційне сухе середовище (ВТДМ), для визначення ферменту цистинази - комерційне сухе середовище для визначення ферменту цистинази, що є аналогом середовища Пізу. Кращою основою для приготування середовищ для визначення токсигенності та цистинази залишається мартенівський пептон, який готують в умовах лабораторії або у відділах поживних середовищ деяких НДІ.

При приготуванні поживних середовищ для визначення токсигенності використовують нормальні сироватки коня або великої рогатої худоби (ВРХ). Сироватки непридатні, якщо вони каламутні, гемолізовані (червоного, бурого кольору) або на них є позначення " для технічних цілей". Необхідно здійснювати попередній контроль усіх серій сироватки, що надходять до лабораторії, з токсигенним контрольним штамом на перевіреному середовищі на токсигенність і контроль на відсутність протидифтерійних антитоксичних антитіл в кінських сироватках в РПГА з дифтерійним антигенним діагностикумом (див. інструкцію до препарату).

Для відсіву колоній та культивування коринебактерій готують сироватковий агар на будь-якій поживній основі, що застосовується для культивування коринебактерій дифтерії.

Застосування звернутої сироватки недоцільне.

Для визначення сахаролітичних властивостей використовуються середовища на 1% пептонній воді.

Дозволяється використовувати тільки ті імунобіологічні препарати, що зареєстровані і дозволені до використання в Україні.

Перелік імунобіологічних препаратів, що зареєстровані і дозволені до використання в Україні надано в додатку 3.

Терміни та умови зберігання діагностичних препаратів, поживних середовищ, їх компонентів, фарб та індикаторів наведені в додатку 1.

Усі хімічні реактиви, що використовуються при приготуванні поживних середовищ, повинні бути кваліфікації ЧДА, якщо в рецептурі нема інших вказівок.

Виготовлення поживних середовищ

Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10.444.1-84.

7.1. Транспортні середовища

Транспортне напіврідке середовище (модифікація Ю.М.Фельдмана)

З сухих комерційних агарових препаратів готують середовище з розрахунку 1 г поживного агару на 100 куб. см перевару Хоттінгера або поживного бульйону. Вміст амінного азоту – 150-180 мг %, pH – 7, 6.

Стерилізують в автоклаві при 121 ±1 °C протягом 20 хвилин або при 112 ± 1 °C –
30 хвилин, асептично додають 10 куб. см сироватки та 1 куб. см 2 % телуриту калію. Розливають в пробірки по 5 куб. см. Середовище вибірково контролюють на стерильність в термостаті протягом 48 годин.

Транспортне середовище ЕМЄС (AMIES)
(модифіковане Стюартом)

Дистильована або очищена вода..................... 1 куб. дм

Агар................................................................... 4 г

Розчинити, нагріваючи до кипіння, охолодити і внести такі інгредієнти:

NaCl.................................................................... 3, 0 г

KCl..................................................................... 0, 2 г

Na PO безводний.............................................. 1, 15 г

KH PO................................................................ 0, 2 г

Тіогліколат натрію............................................ 1, 0 г

CaCl (1 % щойно приготований розчин)........ 10 куб. см

MgCl |6PO (1 % розчин).................................... 10 куб. см

Перемішати до повного розчинення і додати 10 г деревного вугілля. Ретельно перемішати, розлити у пробірки об'ємом 7 куб. см, наповнюючи їх майже до вінець, і закрити пробками, що закручуються. При відсутності таких пробірок, використовують звичайні, зберігаючи той же принцип. Автоклавувати при 121 ±1 °C протягом 15 хвилин. Переконатися, що пробірки закриті щільно, і охолоджувати в перевернутому вигляді, щоб вугілля в середовищі розподілилось рівномірно. Кінцева pH середовища – 7, 2.

Зберігати в темному прохолодному місці.

7.2. Середовища для первинного посіву досліджуваного матеріалу

Кров'яний агар. До 100 куб. см 2 % розплавленого і охолодженого до 50 °C поживного агару (pH – 7, 6) стерильно додають 10 куб. см крові, ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.

Кров'яно-телуритовий агар (КТА). До 100 куб. см 2 % поживного агару pH – 7, 6 (3, 5 або 5 г сухого поживного агару, виходячи з пропису на етикетці, на 100 куб. см різних бульйонів або дистильованої води), розплавленого і охолодженого до 50 °C, додають 2 куб. см 2 % розчину телуриту калію і 10-15 куб. см гемолізованої крові (або кров'яної суміші).

Поживні агарові основи розливають в стерильні флакони і стерилізують при 112 ±1 °C протягом 30 хвилин з попереднім прогрівом текучою парою при 100 °C протягом 3 хвилин.

Пам'ятати! Поживні середовища для первинного посіву розливають у чашки Петрі шаром 3-4 мм.

Середовище Клауберга II. До 100 мл 3 % поживного агару pH – 7, 6, розплавленого і охолодженого до 50 °C, додають 3 мл 2 % розчину телуриту калію, 10 мл гліцеринової суміші та 50 мл " лакової" крові.

Приготування гліцеринової суміші. До 40 мл дефібринованої крові (або розбитих у фізіологічному розчині згустків, еритроцитарної маси) додати 20 мл стерильного (при температурі 110 °C протягом 30 хвилин) гліцерину. Якщо кров, згустки, еритроцитарна маса, які використовуються, були не стерильні, то кров'яну гліцеринову суміш необхідно витримати в холодильнику при температурі 6 ±2 °C протягом 3 тижнів. Зберігають в умовах холодильника протягом 4-х місяців.

Приготування " лакової" крові. До 34 мл стерильної дистильованої води додати 16 мл дефібринованої крові (або розбитих у фізіологічному розчині згустків).

Приготування розчину телуриту калію (K TeO) 2 3. Для приготування телуритових середовищ використовують комерційний препарат 2% розчин телуриту калію або його готують таким чином: у 100 куб. см дистильованої води розчиняють 2 г телуриту калію. Розчин стерилізують нагріванням на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин і зберігають при кімнатній температурі. При випаданні осаду розчин знову нагрівають на водяній бані до повного його розчинення. При поганій розчинності реактиву готують 1 % розчин, але відповідно додають його до середовищ у подвійному об'ємі. Сухий телурит калію зберігають в посудині з темного скла з притертою пробкою, зважаючи на його гігроскопічність та токсичність. Розчин перевіряють, виготовивши середовища, титрованою кількістю коринебактерій дифтерії і стафілокока у відповідності з описаною методикою.

Приготування крові, кров'яних і кров'яно-телурових сумішей. Використовують найрізноманітніші джерела одержання крові і кров'яних сумішей. Найкращою є дефібринована кров великої рогатої худоби, коней, свиней, овець, кролів. Кров забирають в стерильні бутлі з намистинами, монтуючи спеціальні системи з дотриманням усіх правил асептики. В окремих випадках кров збирають, зливаючи перші порції крові поза бутлем.

Можна використовувати кров людини (цитратну і з консервантами), готуючи з неї спеціальні кров'яні суміші. Необхідною умовою є зливання рідкої відстояної частини крові з цитратом чи іншими консервантами. В залишену еритроцитарну масу додають стільки ж, скільки злили рідкої частини крові, стерильної дистильованої води або фізіологічного розчину чи сироватки і телуриту калію.

Хорошою сировиною для отримання кров'яної суміші є еритроцитарна маса – відходи гамаглобулінового виробництва. Її заливають стерильною дистильованою водою або гліцерином з розрахунку 1/4-1/5 об'єму еритроцитарної маси і додають телурит калію.

Можна використовувати кров'яні згустки після відсмоктування сироватки для виробництва гамаглобуліну, згустки плацентарної крові, одержані безпосередньо від породіль, згустки абортної крові. Згустки збирають в стерильні бутлі зі скляними намистинами або битим склом і розбивають їх. Якщо не вдається розбити, згустки заморожують і розморожують (2-3 рази на добу ставлять в морозильну камеру), після чого вони легко руйнуються. Потім додають стерильний фізіологічний розчин або дистильовану воду 1/4-1/5 об'єму згустків і телурит калію.

Для кращого збереження крові чи кров'яної суміші до кожної порції об'ємом 10-15 куб. см, додають до 100 куб. см агару, доливають 1 куб. см 2 % розчину телуриту калію. Таку суміш можна зберігати в холодильнику до 2-х місяців.

Для приготування кров'яного телуритового середовища на кожні 100 куб. см поживного агару додають від 11 до 16 куб. см кров'яної телуритової суміші і 0, 1 куб. см 2 % розчину телуриту калію. Приклад розрахунку: до 200 куб. см еритроцитарної маси, що лишилась після того, як злили 30 куб. см рідкої відстояної частини крові з консервантом, додали 30 куб. см сироватки або дистильованої води чи фізрозчину. Таким чином, отримали 230 куб. см кров'яної суміші, що складає приблизно 21 порцію, якщо додавати по 11 куб. см цієї кров'яної суміші до кожних 100 куб. см агару. Для консервації 230 куб. см кров'яної суміші необхідно додати 1/2 порції телуриту калію, тобто 21 куб. см. Надалі готувати кров'яні телуритові середовища потрібно наступним чином – до 100 куб. см агару додати 12 куб. см кров'яної телуритової суміші і 1 куб. см 2 % розчину телуриту калію.

Сироватковий агар. До 100 куб. см розплавленого і охолодженого до 50 °C поживного агару (pH – 7, 6) стерильно додають 10 куб. см сироватки. Перемішують, розливають в стерильні пробірки по 3-4 куб. см і скошують. Кожна партія сироваткового агару перевіряється на стерильність: декілька пробірок цієї партії ставлять на добу в термостат. У випадку проростання середовища знищується вся партія.

7.3. Середовища для визначення токсигенності

Пам'ятати! Поживний агар для визначення токсигенності, розлитий у флакони, вимагає багаторазового розплавлення, а тривала термічна дія значно погіршує його якість. При невеликому об'ємі роботи середовище доцільно розливати в пробірки по 17 куб. см (кількість, необхідна для приготування однієї чашки). При великому об'ємі роботи для одноразового використання розливають в стерильні флакони (70-80 куб. см).

Сухий поживний агар для визначення токсигенних властивостей дифтерійних мікробів (ВТДМ). 3 г сухого порошку ВТДМ розчиняють у 100 куб. см води, ретельно розмішують на слабому вогні, нагрівають до повного розплавлення агару при постійному помішуванні, кип'ятять протягом 5-7 хвилин під закритою ватно-марлевою пробкою, фільтрують через ватно-марлевий або тканинний фільтр. Розливають в стерильній посуд. Стерилізують одноразово текучою парою протягом 30 хвилин. Перед розливанням у чашки Петрі до розплавленого і охолодженого до 50 °C середовища додають 20 % сироватки.

Агар для визначення токсигенних властивостей C.diphtheriae з середовищем 199. Вода дистильована 300 куб. см, середовище 199 - 700 куб. см, агар ВТДМ - 30 г.

Агар ВТДМ розмішати у суміші дистильованої води і середовища 199, кип'ятити до повного розчинення 3-5 хвилин, профільтрувати через ватно-марлевий фільтр, прогріти 30 хвилин на водяній бані. Розлити по 20-22 куб. см в чашки або пробірки.