Методики ідентифікації коринебактерій

6.1. Визначення токсигенних властивостей

В основі методу визначення токсигенності коринебактерій (in vitro) покладено взаємодію між токсином і антитоксином, яка відбувається в твердих поживних середовищах в місцях оптимального кількісного співвідношення токсину, продукованого коринебактеріями дифтерії, що дифундує в агар, і антитоксичних антитіл, які містяться в антитоксині. В тих ділянках агару, де токсин зустрічається з антитоксином, випадає преципітат у вигляді білих ліній, " стріл" чи " вусів" (Елек-тест).

Слід суворо стежити за щільністю середовища, pH, режимом стерилізації, прозорістю, точним дотриманням цілого ряду технічних умов постановки проби.

Токсигенність C.diphtheriae визначають, як правило, в чистій культурі (відбираються окремі колонії і суміш колоній або культури з сироваткового косяка). Культури, забруднені сторонньою мікрофлорою, також можна випробовувати на токсигенність. При відсутності у цих випадках преципітатів у агарі дослід повторюють з виділеними чистими культурами.

Для постановки проби на токсигенність необхідно мати: стерильні чашки Петрі з рівним дном; поживне середовище для визначення токсигенності; паперові смужки; діагностичний дифтерійний антитоксин, або диски з антитоксином; контрольний токсигенний штам; нормальні сироватки тварин.

Засів проби. Якщо для визначення токсигенності використовуються паперові диски з дифтерійним антитоксином, засів культури проводять " бляшками" діаметром 0, 7-0, 8 мм навколо диску (на відстані 0, 5 см від диску), чергуючи " бляшки" досліджуваної культури і контрольного штаму. На одну чашку можна ставити не більше 4 дисків.

Якщо використовують паперові смужки, " бляшки" досліджуваної культури висівають на відстані 0, 7-0, 8 см одна від одної і 0, 5 см - від краю смужки.

При дослідженні на токсигенність половини колонії і суміші 5-6 колоній посів здійснюють " бляшками" з обох сторін смужки. Половину колоній (окремої, ізольованої, або по половині від двох колоній) розміщують на одній стороні чашки, а на другій - суміші колоній. На одну чашку слід висівати не більше 10 " бляшок", з них 6 " бляшок" досліджуваної культури, 4 – контрольного штаму. Контролем служить токсигенний штам 24-48-годинного росту. Чашки з посівом ставлять в термостат.

Облік результатів. Результати враховують через 18-24 та 48 годин. Критерієм оцінки специфічності преципітатів є злиття ліній преципітації досліджуваного штаму з лініями контрольного (токсигенного) штаму. У випадках, коли у контрольного штаму з'являється декілька ліній преципітації, специфічними слід вважати найбільш чіткі преципітати, які з'являються першими. Спостерігаються наступні варіанти в утворенні преципітатів:

1. Досліджувані C.diphtheriae, у яких утворюються преципітати, вважаються токсигенними, якщо ці лінії преципітації зливаються з відповідними специфічними лініями токсигенного штаму або ідуть на сполучення з ними.

2. Досліджувані C.diphtheriae вважаються нетоксигенними:

а) якщо лінії преципітації у досліджуваної культури відсутні при наявності специфічних ліній преципітації у контрольного штаму;

б) якщо лінії преципітації розміщені так, що їх кінці не можуть злитися з кінцями специфічних ліній у контрольного штаму, а ідуть навперехрест з ними (неідентичні);

в) лінії преципітації досліджуваного штаму зливаються з неспецифічними лініями контроль­ного штаму;

г) лінії преципітації досліджуваного штаму перехрещуються із специфічними лініями і злива­ються з неспецифіч­ними лініями контрольного штаму.

Іноді з'являються множинні неспецифічні лінії преципітації.

Найчастіші причини гіподіагностики при визначенні токсигенності коринебактерій:

1. Слабке утворення токсину штамом, що досліджується.

2. Недостатня кількість інокуляту (потрібен масивний засів).

3. Значна віддаленість " бляшки" від смужок (диску).

4. Недостатня концентрація антитоксину на смужці (диску).

5. Низька якість середовища: відхилення pH, висока концентрація агару в середовищі (ускладнюється дифузія), надмірний вміст заліза в агарі.

6. Незадовільна якість нормальної кінської сироватки, що додається до середовища (рекомендується сироватка великої рогатої худоби), надмірне висушування поверхні агару;

7. Недостатня прозорість агару.

8. Незадовільна якість чашок Петрі (дефекти скла, подряпини, наліт і т.д.).

Приготування чашок для постановки проби на токсигенність. На середину поверхні застиглого середовища прожареним пінцетом кладуть стерильні диски або паперову смужку, просочену дифтерійним антитоксином. Чашки підсушують в термостаті протягом 15-20 хвилин, перевернувши догори дном і чашку, і кришку.

Приготування паперових смужок. Смужки фільтрувального паперу нарізають розмі­ром 1, 5 ´ 8, 0 см, загортають по 2-4 штуки в пакетик, стерилізують в автоклаві при 121 ± 1 °C – 30 хвилин.

Змочують смужки в стерильній чашці Петрі. Для цього їх переносять з пакетика стерильним пінцетом і змочують 0, 25 куб. см очищеного специфічною сорбцією дифтерійного антитоксину, який містить 500 МО в 1 куб. см. Щоб не було надлишків антитоксину на папірці, при перенесенні на агар обпаленим пінцетом, його злегка струшують.

Визначення гену дифтерійного токсину за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

ПЛР базується на вибірковій ампліфікації (збільшенні числа копій) специфічної ділянки ДНК коринебактерії, яка містить фрагмент А гену дифтерійного токсину, за допомогою ферменту – термостабільної ДНК-полімерази. Цей фермент приймає участь у синтезі протилежно орієнтованих взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з олігонуклеотидних праймерів. Праймери – штучно синтезовані короткі (5-20 нуклеотидів) одноланцюгові фрагменти ДНК, що комплементарні 3'-5' кінцям нуклеотидної послідовності tox-гену, яка ампліфікується. Праймери обмежують фрагмент ДНК, котрий буде мільйони разів скопійований в ході реакції.

Дослідження методом ПЛР включає три етапи:

1. Підготовка досліджуваного матеріалу:

- виділення ДНК (досліджуваний матеріал або культуру вносять в 1 куб. см дистильованої води, кип'ятять протягом 20 хвилин при 100 °C, центрифугують; надосадова рідина містить ДНК);

- приготування реакційної суміші, до якої входять: буфер з іонами Mg, суміш чотирьох дезоксинуклео­тидтрифосфатів, Taq-полімераза, суміш двох праймерів, внутрішній контроль, дистильована вода та виділена ДНК.

2. Власне полімеразна ланцюгова реакція. Для її виконання необхідний термостат з програмним забезпе­ченням (так званий термоциклер або ампліфікатор). Реакція складається із декількох циклів, що повторюються, в кожному з яких можна виділити три стадії:

- денатурація ДНК (реакційна суміш нагрівається до температури 95 °C, розриваються водневі зв'язки і полінуклеотидні ланцюги, що складають структуру ДНК, роз'єднуються);

- зв'язування праймерів (праймери специфічно гібридизуються з відповідними послідовностями нуклео­тидів tox-гену, обмежуючи специфічну ділянку ДНК, що відповідає за токсигенні властивості коринебактерії);

- ензиматична добудова ДНК (використовуючи праймери та вільні дезоксинуклеотидтрифосфати, термо­стабільна ДНК-полімераза добудовує ланцюг ДНК). Процес синтезу відбувається при 70-72 °C протягом 20-40 сек.

Створені в першому циклі ампліфікації нові ланцюги ДНК служать матрицями для синтезу аналогічних фрагментів (ампліконів). Таким чином, амплікони у розчині накопичуються і їх кількість n становить 2, де n – кількість циклів ампліфікації. Отже, якщо у розчині знаходилась тільки одна молекула ДНК, то за 30-40 циклів у 8 розчині накопичується біля 10 молекул амплікона. Цієї кількості достатньо для достовірної візуальної детекції цього фрагмента методом електрофорезу в агарозному гелі.

3. Детекція продуктів ампліфікації в електрофоретичному аналізі. Для цього етапу необхідні джерело постійного струму, камера для електрофорезу, ультрафіолетовий трансілюмінатор, хімічні реактиви та спеціальні фарбники.

Новостворені ДНК-фрагменти, в більшості мають однакову молекулярну масу, тому в електро­форетичному полі вони будуть пересуватися в агарозному гелі з однаковою швидкістю і спостерігатимуться в ультрафіолетовому промінні у вигляді однієї смужки.

Агарозний гель готують із агарози та буфера, який використовується в електрофоретичній камері, охолоджують до 50-60 °C, заливають в приготовані для цього форми і за допомогою спеціальних гребінців роблять в гелі " кишені" для нанесення зразка. Після застигання гелю в " кишені" вносять підфарбований ампліфікат і проводять електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації протягом 45-60 хвилин. Гель обробляють бромистим етідієм і розглядають в УФ промінні.

Результати оцінюють у порівнянні з позитивним контролем. Якщо зразок, що досліджується, вміщує tox-ген, при фарбуванні бромистим етідієм він утворює специфічну електрофоретичну смужку, яка знаходиться на рівні смужки позитивного контролю. Негативні зразки не повинні утворювати будь-яких смужок. Для документування результатів ПЛР гель фотографують в ультрафіолетовому світлі на фотоплівку " Мікрат-300", яку проявляють звичайним способом, або застосовують апарати типу " Pollaroid".

ПЛР має деякі переваги перед традиційним методом визначення токсигенності C.diphtheriae:

- можливість повної автоматизації;

- швидкість отримання результатів (на протязі 4-6 годин);

- висока чутливість (дозволяє визначити навіть одного збудника в матеріалі, що досліджується);

- 100% специфічність методу (наявність у зразку, що досліджується, сторонньої мікрофлори не впливає на результат реакції, тобто ПЛР не потребує дослідження " чистої культури");

- можливість дослідження практично будь-якого матеріалу.

В той же час ПЛР потребує спеціальної техніки і реагентів, які дорого коштують, відповідних приміщень, а тому може бути виконана тільки в спеціалізованих лабораторіях. В Україні така лабораторія функціонує на базі Українського центру держсанепіднагляду.

Всі нетоксигенні C.diphtheriae, що виділені від хворих та контактних у вогнищах дифтерії необхідно надсилати до Українського центру держсанепіднагляду для подальшого вивчення в ПЛР.

6.2. Визначення біохімічних ознак. Визначення ферменту цистинази (проба Пізу) C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis мають фермент – цистиназу, у C.pseudodiphtheriticum та інших дифтероїдів він відсутній.

В середовище, розлите у вузькі пробірки стовпчиком, засівають культуру уколом. При рості цистиназопозитивні коринебактерії, завдяки цистиназі, розщеплюють цистин, що міститься у середовищі, а сірководень, який при цьому утворюється, вступає у реакцію з оцтовокислим свинцем, що входить до складу середовища, останній переходить в сірчанокислий свинець - сполуку темно-коричневого кольору. Гіпосульфіт натрію, що входить до складу модифікованого середовища, прискорює утворення сірчанокислого свинцю та ідентифікацію цистинази. C.diphtheriae викликають не лише почорніння середовища по ходу уколу, але й утворюють навколо нього " хмарку" темно-коричневого кольору на відстані 1 см від поверхні.

Результати враховуються через 24 години. Для отримання попередньої відповіді (через 3 години) необхідно внести в середовище багато культури (5-6 колоній). Рекомендується одночасно ставити контроль середовища.

Визначення фермента піразинамідази

Тест дозволяє диференціювати патогенні коринебактерії (негативний результат) від інших коринебактерій (позитивний результат). Фермент піразинамідаза каталізує гідроліз піразинаміда до піразинової кислоти та амонію.

Для постановки тесту в стерильну пробірку вносять 0, 25 куб. см стерильної дистильованої води. Готують в ній густу (як " молоко") суспензію досліджуваної культури. Таким же чином готують суспензії позитивного та негативного контрольних штамів.

Стерильним пінцетом вносять в кожну пробірку по одній діагностичній таблетці Rosco № 598-21. Інкубують при 37 °C протягом 4 годин.

Для обліку результатів у кожну пробірку додають по 1 краплі 5% водного розчину сульфату амонійного заліза (щойно приготованого або такого, що зберігався при – 20 °C).

Патогенні коринебактерії (C.C.diphtheriae, pseudotuberculosis, ulcerans) не змінюють кольору суспензії у пробірці (негативний результат), вона залишиться безбарвною або жовтуватого кольору. Інші коринебактерії змінюють колір суспензії (позитивний результат) на червоний або оранжевий.

Визначення фермента уреази

Псевдодифтерійні бактерії, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis і деякі інші мікроорганізми роду Corynebacterium мають фермент уреазу, здатний розщеплювати сечовину з утворенням аміаку і вуглекислоти. C.diphtheriae цим ферментом не володіють.

Пробу на уреазу можна ставити в двох варіантах: шляхом посіву на бульйон з сечовиною та за методом Заксе:

а) в бульйон з сечовиною засівають чисту культуру коринебактерій і ставлять в термостат. Облік результатів проводять через 18-24 години;

б) метод Заксе. Змішують (ex tempore) реактив A (1 частину) і реактив B (19 частин). Суміш розливають у вузькі пробірки по 0, 1 куб. см і вносять кілька петель досліджуваної культури. Не можна брати конденсаційну воду, оскільки вона має лужну реакцію і може змінити pH середовища, а отже і колір індикатора. Пробірки ставлять в термостат на 30 хвилин.

Уреаза розщеплює сечовину, змінює pH середовища, що призводить до його почервоніння. Якщо фермент уреаза відсутній, зміна забарвлення середовища не відбувається. Рекомендується одночасно ставити контроль середовища.

Визначення сахаролітичних ферментів

Сахаролітичну активність коринебактерій дифтерії визначають на середовищах з вуглеводами: сахарозою, глюкозою і розчинним крохмалем.

Повну петлю культури вносять в кожну пробірку з середовищем. Облік результатів проводять через 24 години, а при негативній крохмальній ознаці - враховують тест через 48 годин перебування посівів в термостаті.

При зброджуванні вуглеводів, тобто при кислотоутворенні, спостерігається відновлення знебарвленого фуксину і середовище набуває малинового кольору.

Відновлення нітратів в нітрити

Здатність коринебактерій дифтерії відновлювати солі азотної кислоти (нітрати) в солі азотистої кислоти (нітрити) є додатковою ознакою, що дозволяє ідентифікувати C.belfanti і C.ulcerans, у яких ця ознака негативна. Пробірки з середовищем засівають культурою, що вивчається, і інкубують в термостаті 24 години. Для контролю інкубують пробірку з середовищем, не засіяним культурою. Якщо нітрат відновлено в нітрит, то, при додаванні 3 крапель реактиву Грісса або Касаткіна до засіяного середовища, з'являється червоне забарвлення. Середовище в контрольній пробірці кольору не змінює.

Використання паперової індикаторної системи для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae

Для ідентифікації та визначення біоварів C.diphtheriae можуть використовуватись паперові індикаторні диски з глюкозою, сахарозою, сечовиною та крохмалем, з набору " Б" для ідентифікації ентеробактерій, що випускається фірмою " ІмБіо", м. Нижній Новгород. Виготовлення дисків з крохмалем та для визначення нітрат-редуктази наведено в розділі " Поживні середовища".

Готується густа суміш мікробів в об'ємі 1, 2-1, 5 куб. см стерильного 0, 85% розчину хлориду натрію з pH 7, 3 ±0, 1 і по 0, 3 куб. см переноситься в 4 пробірки. В кожну пробірку занурюють диск з відповідним вуглеводом. Пробірки поміщають у термостат. Облік результатів проводять через 40 хвилин – 2 години для визначення уреазної активності і 5-24 години - для визначення сахаролітичних властивостей.

При наявності уреази білий диск з сечовиною забарвиться в рожево-малиновий колір, при відсутності - залишиться білим.

Диски з глюкозою та сахарозою при наявності відповідних ферментів змінять червоний колір на жовтий вже через 5-6 годин.

Для визначення крохмальної ознаки через 18-24 години інкубації в пробірку з відповідним субстратним диском додають індикаторний диск з йодом. Через 1-2 хвилини після цього, при негативній реакції з'являється темно синє забарвлення, при позитивній – колір розчину залишається без змін.