Носители электрофореза

Бумага

Этот метод нашел широкое применение и открыл путь для аналитических исследованиях во многих областях. Бумажный электрофорез является одним из наиболее распространенных способов зонального электрофореза, в котором поддерживающей средой служит специальная фильтровальная бумага.

Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов.

Фильтровальная бумага для электрофореза должна содержать 96% -целлюлозы, нерастроворимой в концентрированном растворе NaOH. В процессе электрофореза бумага пропитывается буферным раствором. Разные марки бумаги обладают неодинаковой впитывающей способностью ─ свойством, имеющим большое значение, так как электропроводность влажной бумаги зависит от объема содержащегося в ней буфера.

Тонкая или средней толщины бумага с плотной текстурой дает при электрофорезе четкий фронт, тогда как толстая (быстро протекающая) бумага, обладающая большой впитывающей способностью, характеризуется нечетким фронтом. Некоторые для препаративного электрофореза белков применяют толстую бумагу.

Бумагу погружают в буферный раствор, слегка промокают между чистыми листами промокательной или фильтровальной бумаги, а затем помещают на поставку, поддерживающую ее в соответствующем положении. Пробу наносят либо капиллярной пипеткой с закругленным носиком, либо с помощью различных аппликаторов, обеспечивающих быстрое и равномерное нанесение исследуемого раствора. При этом важно не поцарапать поверхность бумаги. После нанесения проб к кювете подключают напряжение. Для наблюдения за ходом электрофореза на бумагу наносят пятно окрашенного стандартного вещества. По окончании процедуры бумагу быстро высушивают при 105-110 °С (20-30 мин).

Агароза

Агароза, природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом (средняя молекулярная масса ~12 000 Да), образованным повторяющимся элементом – агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов: галактозы и 3, 6 –ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка, и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются преимущественно для разделения больших молекул с молекулярной массой большей, чем 200 кДа.

Разделение в агарозных гелях происходит быстро, но с ограниченным разрешением, так как полосы, образующиеся в агарозных гелях, имеют тенденцию размываться диффундировать и распространяться в стороны. Это является результатом большого размера пор и не может быть предотвращено. Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс, плотность которого определяется концентрацией.

Современные варианты электрофореза используют пластинки или колонки с агарозным гелем. В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном геле может быть аналитическим и/или препаративным. Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью элек- трофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ а- цией и анализом полученных результатов. Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для извлечения из геля разделенных компонентов используют несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др.

Полиакриламидный гель

Полиакриламид─ общее название группы полимеров и сополимеров на основе акриламида и его производных. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличиймолекулярных масс, а также от конфигурации молекул.

Разделяют т. н. неденатурирующий, или нативный ПААГ-электрофорез (при котором разделяемые биологические макромолекулы в процессе электрофореза остаются в нативном состоянии) и денатурирующий ПААГ-электрофорез (при котором пробы предварительно денатурируют, в случае нуклеиновых кислот используют непродолжительное нагревание пробы с формамидом либо глиоксалем, для денатурации белков обычно используют кипячение пробы в буфере, содержащем сильный ионный детергент (обычно додецилсульфат натрия) и агент, разрушающий четвертичную структуру белка за счёт разрушения дисульфидных мостиков между глобулами белка и внутри полипептидной цепи — бета-меркаптоэтанолом). В процессе денатурирующего ПААГ-электрофореза молекулы сохраняются в денатурированном состоянии за счёт наличия в геле хаотропных агентов в случае ПААГ-электрофореза нуклеиновых кислот и белков и наличия ионных (додецилсульфата натрия, цетилтриметиламмоний бромида) и неионных детергентов.

• В случае электрофореза белков в полиакриламидном геле метод обычно используют в модификации Леммли (Laemmli)
• Также электрофорез в полиакриламидном геле применяют для разделения коротких фрагментов нуклеиновых кислот

• Различают также диск-электрофорез, при котором в геле в процессе электрофоретического разделения белков на границе между концентрирующим и разделяющим гелями создаётся градиент pH, за счёт чего достигается лучшее разделение белковых молекул.

После окончания электрофоретического разделения, зоны распределения макромолекул в геле обнаруживают путем окрашивания специфическими красителями и или другими способами. Например, для обнаружения белков используются красители амид черный, бромфеноловый синий, Кумасси бриллиантовый голубой. Если разделяются биологически активные молекулы, положение молекулы можно идентифицировать по измерению активности, например, по измерению ферментативной активности. Локализацию нуклеиновых кислот в гелях определяют после обработки флоуресцентными красителями (например, бромид этидия) или по радиоактивности разделенных фрагментов.