Тема № 15

Стадии технологического получения моноклональных антител. Сферы практического применения моноклональных антител

572. Селективные культуральные среды, применяемые для получения гибридом. Значение среды ГАТ (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Характеристика.

Основными средами, употребляемыми при получении гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности среда Дульбекко в модификации Искова (эта среда особенно часто используется при иммунизацииm vitro). Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Среда Игла. Среда Игла, как правило, пригодна для культивирования большинства клеточных линий. Среда Игла содержит соли, глюкозу, 12 незаменимых аминокислот и 9 витаминов. Перед употреблением вместе с сывороткой добавляются глютамин и, если необходимо, антибиотики.[3]

Среда RPMI 1640. Среда представляет собой растворенную в очищенной воде смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы и фенолового красного, простерилизованную фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0, 1 мкм.

Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0, 22 мкм.

В настоящее время разработано несеолько принципов селекции гибридных клеток. Одним из наиболее распространенным является метод, основанный на применении системы ГАТ, содержащей гипоксантин (Г), аминоптерин (А), тимидин (Т). В среде ГАТ происходит отделение неслившихся миеломных клеток и лимфоцитов от гибридом, выживают на такой среде только гибридные клетки.

Аминоптерин (4-аминофолиевая кислота) блокирует основной путь биосинтеза нуклеотидов для всех клеток. Этот препарат обладает сильным цитостатическими свойствами, как аналог фолиевой кислоты он блокирует синтез пуринов, тимина и других аминокислот при этом происходит повреждение клеток, особенно быстрорастущих.

Гипоксантин и тимидин добавляют в среду в качестве предшественников пуринов и пиримидинов, использующихся для синтеза нуклеотидов по резервному пути биосинтеза с участием ТК и ГГФРТ.

Миеломные клетки погибают на среде ГАТ, т.к. из-за дефектности по ТК и ГГФРТ не способны использовать гипоксантин и тимидин для синтеза нуклеотидов.

Неслившиеся лимфоциты отмирают через несколько дней после гибридизации, т.к. они не способны к длительному выживанию in vitro.

Таким образом, на среде ГАТ должны выживать только непрерывно растущие клоны гибридных клеток. В гибридомах будут экспрессированы гены миеломных клеток и В-лимфоцитов. От миеломных партнеров наследуются способность к неограниченному росту в культуре или in vivo, а от В-лимфоцитов селезенки – способность к продукции антител известной специфичности и возможность использовать обходной путь синтеза нуклеотидов при участии ТК и ГГФРТ.