Аппаратура для измерения люминесценции растворов

Для регистрации спектрального состава люминесценции используют приборы, называемые спектрофлуориметрами или люминесцентными спектрометрами. На рисунке 26 приведена принципиальная схема такого прибора.

Рис. 26. Блок-схема спектрофлуориметра.

1 – источник возбуждения (лампа), 2 – линзы, 3 и 6 – монохроматор возбуждения, 4 – поворотное зеркало, 5 – кювета с образцом, 6 - монохроматор испускания, 7 – ФЭУ; 8 – система вывода данных.

В качестве источника возбуждающего света в приборе чаще всего использует­ся ксеноновая лампа. Прибор снабжен монохроматорами для выделения отдельной длины волны как возбуждающего, так и испускаемого света. Оба монохроматора снаб­жены моторами, что обеспечивает автоматическое сканирование по дли­нам волн. Флуоресценция попадает на фотоумножители и затем количест­венно измеряется с помощью соответствующих электронных устройств. Выходной сигнал обычно представляется графически на мониторе компьютера или встроенном дисплее.

3. Экспериментальная часть

3.1 Регистрация спектров флуоресценции пигментов

Возьмите лист растения, разделите его на 3 части: 1-ая часть будет исследоваться в целом виде, из 2-ой части следует приготовить водный гомогенат, а из 3-ей – ацетоновый экстракт (согласно инструкции на стр. 136-137 «Практикума по общей биофизике»).

Зарегистрируйте спектры флуоресценции растительных пигментов в трех образцах:

- целом листе (расположите кусок листа в кювете по диагонали, но лучше 60° к направлению возбуждающего луча)

- водном гомогенате (в кювету достаточно налить 2 мл, раствор должен быть не густо окрашен, слегка зеленый)

- ацетоновом экстракте (в кювету следует налить 2 мл)

Условия регистрации: длина волны возбуждения – 430 нм, диапазон сканирования - 600-800 нм, скорость сканирования – 6 нм/с, высокое напряжение на ФЭУ выбрать, исходя из уровня сигнала на длине волны 680 нм.

3.2 Проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации:

Измерьте спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте, разведенном в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза. Для этого заберите из кюветы 1 мл исходного экстракта и добавьте 1 мл ацетона (получили разведение ½). Перемешайте содержимое кюветы и измерьте спектр (условия аналогичные п. 3.1). Повторив данную манипуляцию еще 5 раз, получите спектры разведений ¼, 1/8, 1/16, 1/32 и 1/64.

Внимание, опасность! В течение данного эксперимента необходимо подавать ОДНО И ТО ЖЕ напряжение на ФЭУ для всех разведений. Имейте в виду, что для разведений ½, ¼, 1/8 максимальная интенсивность люминесценции может увеличиться в 3-5 раз по сравнению с исходным экстрактом. При измерении исходного экстракта не следует подавать слишком большое напряжение на ФЭУ, оставляя запас «сверху», чтобы иметь возможность корректно измерить последующие образцы.

4. Составление отчета

4.1 Предоставляемый для отчета материал

Диаграмма 1: Нормированные спектры люминесценции пигментов в 3-х средах: целом листе, водном гомогенате, ацетоновом экстракте.

Диаграмма 2: НеНормированные спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте: исходный экстракт и все разведения

Диаграмма 3: Зависимость максимальной интенсивности люминесценции ацетонового экстракта от концентрации I_max(C) (концентрацию выражать в долях от единицы).

Таблица 1: Параметры измеренных спектров люминесценции:

4.2 Что, как минимум, следует проанализировать в отчете и вынести в выводы:

1) Спектры каких пигментов Вы наблюдали в эксперименте (воспользуйтесь Приложением 1)

2) Как смещается максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту? Почему?

3) Рассчитайте энергию флуоресцентного состояния (в см^-1) в каждом образце.

4) Смещается ли максимум флуоресценции пигментов в ацетоновом экстракте при уменьшении концентрации? Если да, то почему?

5) Выполняется ли линейность зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации? Почему? Какой диапазон концентраций пригоден для проведения количественного анализа?

ПРИЛОЖЕНИЕ 1