Методы иммобилизации

Как известно, в клетках ферменты находятся не в растворённой форме, а прикреплены к определённым структурам и локализованы в органеллах. Это связано с тем, что ферменты не стабильные соединения и при воздействии ряда физических и химических факторов могут инактивироваться.

Иммобилизованными ферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами:

1.Такие ферменты представляют собой гетерогенные катализаторы, легко отделяющиеся от реакционной среды;

2. Могут использоваться многократно;

3.Обеспечивают непрерывность каталитического процесса.

Кроме того, иммобилизация ведёт к изменению свойств фермента:

- Субстрактной специфичности;

- Устойчивости;

- Зависимости активности от параметров среды.

Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом.

Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Материалы (носители) для иммобилизации ферментов.

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими свойствами:

1. Нерастворимостью;

2. Высокой химической и биологической стойкостью;

3. Значительной гидрофильностью;

4. Достаточной проницаемостью как для ферментов, так и для субстратов и продуктов реакции;

5. Способностью носителя легко активироваться.

В зависимости от природы носители делятся на:

1. Органические материалы;

2. Неорганические материалы.

Органические полимерные носители можно разделить на 2 класса: а) природные; б) синтетические. В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители, а среди синтетических: полиметиленовые; полиамидные; полиэфирные носители.

К преимуществам природных носителей следует отнести: 1. Доступность; 2. Полифункциональность; 3. Гидрофильность, а к недостаткам – высокую стоимость.

Синтетические полимерные носители включают полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые поли меры. Их преимущество: 1. Механическая прочность; 2. Возможность варьирования в широких пределах величины пор и введения различных функциональных групп. Синтетические полимеры воспроизведены в таких изделиях, как трубы, волокна, гранулы. Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

Носители неорганической природы представляют собой материалы изготовленные из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, а также силохромы и оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают плёнкой оксидов алюминия, титана, циркония. Или обрабатывают органическими полимерами.

Основное преимуществ о неорганическихносителей: лёгкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Итак, к настоящему времени создано огромное число разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального фермента, используемого в конкретном технологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

Методы иммобилизации ферментов.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов:

1.Без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации);

2.С образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис. 10.3).

Рис. 10.3. Методы иммобилизации ферментов

Физические методы иммобилизации ферментовреализуются посредством:

1. Адсорбции ферментов на нерастворимых носителях;

2. Путём включения энзимов в поры поперечно сшитого геля;

3. Включение ферментов в полупроницаемые структуры (1. инкапсулирование и 2. включение ферментов в липосомы).

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счёт электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей.

Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э. Гриффин, 1916 г), но и сейчас не потеряла своего значения и стала широко распространённым способом получения ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием таких носителей, как кремнезём, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто.

Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем при перемешивании. С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таких условиях иммобилизации сохраняется практически на 100%, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации может произойти десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида).

Иммобилизация ферментов путём включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путём включения в трёхмерную структуру полимерного геля широко распространён благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но даже отдельных клеток. иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами:

1. Фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включёнными в его ячейки молекулами фермента.

2. Фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние.

Для первого варианта используют гели: полиакриламида, поливинилового спирта, силикагеля. Для второго: гели крахмала, агар-агара, агарозы, фосфата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объёме носителя. Все гели обладают высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включённого в его структуру.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры

(1.инкапсулирование и 2.включение ферментов в липосомы).

Сущность этих способов иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано две модификации этого направления, которых представляют собой микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Метод инкапсулирования разработан Т. Чангом в 1974 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонсистенции двух соединений, одно из которых растворено с водой, а другое – в органической фазе.

Размер получаемых капсул составляет сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.

Достоинство метода микрокапсулирования – простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента, поскольку он может быть отделён от непрореагировавшего субстрата процедурой простого фильтрования. Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию вариантом иммобилизации является метод включения водных растворов ферментов в липосомы, т. е. двойные липидные (жировые) шарики. Впервые данный метод был применён для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 году. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую плёнку липидов выдерживают в водном растворе, содержащем фермент. В процессе выдержки происходит самовпитывание (самосборка) липидных структур липосомы, содержащих данный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путём включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и биотехнологических целях.

Химические методы иммобилизации ферментов. Представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем – наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических вариантов, эти методы иммобилизации обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создаёт трудности в осуществлении каталитического процесса. Ферменты отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, или спейсер), в роли которой чаще всего выступают полифункциональные агенты бромциан, гидразин, глутаровый диальдегид. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединённые между собой ковалентными связями.