Создание разных видов трансгенных животных

Что касается применения переноса генов у сельскохозяйственных животных, то надежды учёных в настоящее время связаны с улучшением продуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создания так называемых «генных форм» или трансгенных животных – биореакторов ценных биологически активных веществ.

Одним из основных направлений применения генной инженерии являетсяизменение наследственности животных в отношении увеличения скорости роста, повышения надоев и улучшения качества продукции.

Рост животного является сложным процессом, который зависит от действия генов, условий кормления и факторов окружающей среды. С генетической точки зрения особенно интересны гены, кодирующие протеины релизинг фактора гормона роста (РФ-ГР) и инсулинподобный фактор гормона роста (ИФ ГР).

Ещё в 40-е годы ХХ в. было установлено стимулирующее действие гипофизарного ГР на молочную продуктивность коров. Однако ввиду высокой стоимости препаратов гипофизарного ГР и невозможности его получения из гипофизов животных в больших количествах они не нашли практического применения.

К концу 70-х годов, с началом эры генной инженерии и появлением дешёвых гормональных препаратов, полученных путём микробиального синтеза, на основе технологии рекомбинантной ДНК, был синтезирован ГР. Было доказано, что гормон роста микробного происхождения оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и ГР полученный из свиных гипофизов. При этом установлено, что:

1. При крупномасштабном применении рекомбинантного ГР (13 мг в день) увеличение удоев у коров составляет 23 – 31%. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие проводить обработку один раз в две недели и даже в месяц.

2. Для ускорения роста свиней при инъекции ГР необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У потомства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифицированный кормовой рацион, наблюдались на 16, 5% более высокие среднесуточные приросты (Г. Брем и др., 1991). Трансгенные свиньи имеют более чем двукратное уменьшение толщины шпика (18-20 мм у контрольных животных против 7-8 мм у трансгенных). Аналогичным образом трансгенные овцы имели 5-7 % жира по сравнению с 20-30% у контрольных животных.

3. Ежедневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота и овец вызывают увеличение живой массы на 20-30% и сопровождаются сокращением расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней ускорение роста сопровождается увеличением содержания белка и уменьшением содержания жира в тканях, что повышает ценность мясной продукции.

Трансгенные животные с устойчивостью к заболеваниям.

Потери, вызванные заболеваемостью у сельскохозяйственных животных, составляют более 10% стоимости продукции. Поэтому всё большее значение приобретает селекция животных по резистентности к заболеваниям. Резистентность – это наследственная генетически обусловленная восприимчивость животных к определённым микроорганизмам, вирусам, паразитам или токсинам.

В настоящее время: 1. Получен крупный рогатый скот с примесью крови зебу, который устойчив к ряду кровепаразитарных заболеваний. Резистентность к ряду заболеваний является полигенным признаком, как, например, трипанотолерантность определённых африканских пород крупного рогатого скота. 2. Получена резистентность коров не только к вирусу лейкоза, но одновременно животные отличались хорошей жаровыносливостью и нетребовательностью к условиям содержания и кормления. При этом механизмы резистентности основываются на единичных генах. 3. Получена резистентность к диарее у новорожденных поросят, обусловленная E. coli K88.

Продолжаются исследования по получению трансгенных животных с чужеродными генами, которые обеспечат невосприимчивость животных и к другим заболеваниям.

Защитные механизмы от инфекционных заболеваний функционируют путём препятствия вторжения возбудителя или путём изменения рецепторов. Вторжению или размножению возбудителей препятствуют, главным образом, иммунные механизмы и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости, а также иммунологические способности различных молекул, таких, как интерферон, гормоны.

4. В Голландии завершаются исследования по получению трансгенных коров, способных повысить содержание лактоферина в тканях молочной железы, с целью повышения резистентности к маститу.

Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов. Эндогенные вирусные белки, в особенности их мутационные формы, могут служить защитой от соответствующих вирусов. 5. Получены трансгенные куры, устойчивые к вирусу лейкоза, у которых в клетках экспрессировался белок вирусной оболочки.

Приведённые выше данные открывают реальные перспективы повышения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.

Качественные изменения в составе молока. Молоко наряду с присущей ему ценностью может быть использовано в качестве транспортного средства для других веществ, которые усиливают не только его питательные, но также и функциональные свойства. Например, продуцируется лактоферин, белок человеческого молока с бактериостатическими свойствами. В опытах (G. Platenburg et al., 1994) установлено, что лактоферин увеличивает адсорбцию железа и способствует сохранности потомства, путём ограничения наличия свободного железа в межклеточном пространстве тракта, контролируя тем самым размножение бактерий. В результате опытов получен трансгенный бык, несущий человеческий ген лактоферина.

Согласно принятому Постановлению Совета Министров Союзного государства от 15 октября 2002 года № 34 была утверждена программа «БелРосТрансген-1». Головным исполнителем определён Институт биологии гена Российской академии наук (координатор проекта профессор И. Гольдман – директор трансгенного банка Института биологии гена РАН, исполнитель – сотрудник института биологии гена доцент С. Кадулин); исполнителем – РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству» (координатор проекта академик И. Шейко, исполнитель – доцент А. Будевич). После сотен операций по вживлению человеческого гена в ДНК коз родились двое трансгенных козлят (Лак-1 и Лак-2), которые станут родоначальниками стада. Это позволит в недалёком будущем, согласно второго этапа проекта («БелРосТрансген – 2), наладить на территории Республики Беларусь производство лактоферина, созданного на основе белка женского молока, который в 10 раз снижает заболеваемость гастроэнтеритами детей в период искусственного вскармливания. Годовая потребность Союзного государства не менее 10000 кг.

Речь здесь идёт о получении в промышленных масштабах лекарства четвёртого поколения – самого современного в борьбе с различными заболеваниями, а также большой экономической выгоде, которую сулит для Республики Беларусь реализация этой программы. Учитывая, что стоимость одной дозы лактоферина, произведённого методом микробного синтеза составляет 2, 0 – 2, 5 тыс. долларов, использование предлагаемой технологии получения лекарственных белков человека из молока трансгенных животных позволит снизить стоимость этого препарата в 10-20 и более раз, что сделает его общедоступным.

Не менее, если не более важно и то, что реализация программы позволит в обоих государствах или, может быть, в Союзном государстве создать научную основу и технологическую базу для современного биофармпроизводства с использованием трансгенной технологии, не требующего капитального и энергоёмкого строительства дорогостоящих производственных помещений.

Учёные предполагают, что изучение генома человека уже в ближайшее время приведёт к открытию новых регуляторных белков человека, на основе которых будут созданы лекарственные препараты ещё более нового поколения. Экономическая выгода, которую могут дать трансгенные животные-продуценты, как считает Президент Национальной академии наук Беларуси Михаил Мясникович, - в 100-1000 раз превышает ту, которую дают другие биологические системы при создании лекарственных препаратов».

Реализация программы важна ещё и тем, что именно в этой области отставание учёных Союзного государства в наработках по рассматриваемой проблеме небольшое и, поэтому, вполне по силам состязаться с зарубежными коллегами. В технико-экономическом обосновании проведения совместных научных исследований по Программе Союзного государства говорится: «В части разработки и производства новых «генетических лекарств» и лидеры фармакологии, и аутсайдеры находятся сейчас как бы в равном стартовом положении».

Бактериостатическое влияние может быть также достигнуто другими белками, направленными непосредственно в молочную железу и вызывающими уменьшение заболевания маститами. Например, лизоцим оказывает не только антибактериальное влияние, но также способствует увеличению выхода сыра вследствие его связи с казеинами. Он оказывает пассивный иммунитет у новорожденных с секрецией специфических антител.

Таким образом, включение человеческого лактоферина или человеческого лизоцима является примером возможности использования их в качестве целебных свойств молока животных и при потреблении в пищу человеком.

Трансгенные животные, продуцирующие биологически активные вещества медицинского и технологического назначения.

На первом этапе практического применения молекулярной генетики были созданы рекомбинантные микроорганизмы, а позднее трансгенные клеточные линии млекопитающих, которые выращивались в системах биореакторов и были способны производить белки, закодированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были успешно использованы в получении ценных продуктов фармакологического и медицинского назначения, таких как инсулин, некоторые кровесвёртывающие факторы, человеческий гормон роста и др.

По сравнению с трансгенными животными, как продуцентами ценных биологически активных белков, микроорганизмы и клеточные системы имеют следующие недостатки:

1. Выход белка из культуральных клеток более низкий.

2. Процесс выращивания клеток приводит к изменению структуры протеинов и, как следствие, к снижению их биологической активности.

3. Создание данных клеточных культур в промышленных реакторах, является сложной и дорогой процедурой.

Преимущества трансгенных животных: 1. Животные лишь в начале могут быть трудно создаваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких особей воспроизведёт себе подобных. 2. Они могут продуцировать чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью. Поэтому наибольший прогресс, в создании трансгенных биореакторов, достигнут в целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина, в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы.

3. Выделение рекомбинантного белка с молоком, с одной стороны, удобный приём его получения от животного с применением естественного приёма традиционного доения, а с другой стороны, безопасен для животного.

4. Одним из основных этапов в получении трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены промоторы аS1-казеина, ß -казеина, α -лактольбумина; ß -лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP).

Использование молочной железы для производства чужеродных протеинов обосновывается её огромной синтетической белковой продуктивностью. Общая концентрация эндогенных молочных белков в зависимости от вида животных составляет 2-10% (табл. 9.1)т. е. на уровне 20-100 г на 1 л. Этого достаточно для коммерческого производства фармацевтически важных белков.

Таблица 9.1. Содержание белка в молоке разных видов животных

Среди рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных животных, известны следующие:

- человеческий белок С;

- альфа -1- антитрипсин;

- химозин.

Получение этих белков достигло такой стадии, которая представляет коммерческий интерес. В 2006 году разрешено производство и реализация на фармацевтическом рынке сентритромбина, полученного из молока трансгенных коз (фирма «GTC Терапевтик»).

Одним из основных преимуществ трансгенной технологии, является её высокая экономическая эффективность. Потребность мирового рынка в рекомбинантных белках в 2000 году оценивалась в 13 млрд. долларов, а рынок антител в настоящее время составляет более 1 млрд. долларов. Производством белков фармакологического назначения с помощью трансгенных животных занимаются более 20 фирм во всём мире. Если стоимость 1 г рекомбинантного белка в культуре клеток биореактора колеблется в пределах 100-1000 долларов в зависимости от выхода белка и мощности биореактора, то затраты на его производство с молоком сельскохозяйственных животных составляет 40-50 долларов.

Другим преимуществом этой технологии является высокая производственная ёмкость молочной железы трансгенных животных.

Если принять во внимание, что концентрация рекомбинантного белка в молоке будет, по меньшей мере, 1 мг/мл, то можно подсчитать число животных, необходимых для обеспечения количества того или иного фармацевтического белка (табл. 9.2).

Таблица 9.2. Количество трансгенных животных, необходимых для обеспечения мирового рынка отдельными фармацевтическими белками

Из данных таблицы можно сделать вывод, что шести коз и двух коров достаточно, чтобы обеспечить годовую потребность мирового рынка с белке С, тогда как для такого же его производства потребуется 5 млн. литров донорской крови. При этом надо учесть, что использование трансгенных животных позволяет избежать переноса вирусной инфекции.

Группа учёных в Эдинбурге (Великобритания) в 1992г. получила трансгенных овец с человеческим геном альфа-1-антитрипсина и бета глобулиновым промотором. У четырёх овец содержание этого белка составляло более 1 г/ л, а одна овца сначала продуцировала 60 г/л, а затем стабилизировалась на 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. Все овцы здоровы и не имеют каких-либо нарушений лактации. При таком уровне может быть получено более 10 кг белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы лёгких.

Активно проводится работа по созданию трансгенных животных с целью получения от них белков молока обладающих целебными свойствами. Уже созданы в США, Австралии, Японии и Беларуси трансгенные коровы, свиньи, козы продуцирующие лекарственные вещества против: инфекционных заболеваний, тромбоза, гемофилии, малярии, диабета и др.

Группа учёных в Москве (Л. Эрнст, Г. Брем, М. Прокофьев, И. Гольдман, 2004 г) впервые получила трансгенных овец с геном химозина, которые продуцируют с молоком в среднем 200-300 мг фермента химозина в 1 л молока. Этот источник получения химозина может заменить традиционный способ его получения из сычугов молочных телят и ягнят, но его стоимость в 10 раз ниже.

Испытан новый американский препарат – антитромбин, полученный из молока трансгенных животных. Считается, что он является лучшим и произвел революцию в излечении людей от инфарктов.

Созданы трансгенные коровы и козы, в молоке которых содержится человеческий альбумин, способствующий снижению кровяного давления.

В Канаде от выдающейся трансгенной козы получают белки человека на сумму 20 000 долларов ежедневно.