Хроматография

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами. Одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвижная фаза) постоянно движется в определенном направлении.

По свой ствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические методы можно разделить на следующие типы, показанные на схеме (рис. 1.1).

Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.

Хроматограмма и хроматографичеcкие параметры Хроматограммой называют последовательность пятен, зон или пиков, соответствующих компонентам исходной смеси после их хроматографического разделения. Для любого типа хроматографического процесса (см. рис. 1.1), в котором для регистрации результата используется детектор, хроматограмма представляет собой график зависимости сигнала детектора, пропорционального концентрациям разделяемых компонентов, от времени (колоночная хроматография) или расстояния (планарная хроматография). В планарной хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или на ТСХ-пластинке (тонкослой ная хроматография) последовательность пятен компонентов исходной (анализируемой) смеси.

Схема типичной хроматограммы приведена на рис. 1.2. Хроматограмма состоит из пиков, разделенных базовой линией.

Базовая линия соответствует сигналу только от подвижной фазы.

Пик – кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распределения, которая описывает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение.

1.1. Хроматография на бумаге

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, пред- варительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным, адсорбционным или ионообменным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под дей ствием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под дей ствием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.

1.2. Тонкослой ная хроматография

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимерную), называется тонкослой ной хроматографией или хроматографией в тонком слое сорбента (ТСХ).

Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорбционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзионному (гель-проникающему), хиральному или какой -либо их комбинации.

В результате движения анализируемого вещества и элюента под дей ствием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сорбента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

1.3. Газовая хроматография

Газовая хроматография – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит газ, движущий ся через колонку, заполненную неподвижной фазой.

Применяют как газоадсорбционную, так и газожидкостную (преимущественно) хроматографию.

Анализ проводят на специальных приборах – газовых хроматографах.

Основные узлы газового хроматографа: источник подвижной фазы, устрой ство ввода пробы, колонка с термостатом, детектор, система сбора и обработки данных. Требуемые температурные режимы устрой ства ввода пробы, колонки и детектора устанавливаются в соответствующих термостатах.

1.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда называют «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и обращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором используются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с привитыми NH2- или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с различными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии используют неполярные химически модифицированные сорбенты (например, неполярный алкильный радикал C18) и полярные подвижные фазы (например, метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами м олекул.

Часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механи змам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых негазообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

1.5. Хиральная (энантиоселективная) хроматография

Основу хроматографического метода составляет селективное разделение (расщепление) оптически активных соединений на отдельные энантиомеры. Разделение может осуществляется методами газовой и жидкостной хроматографии на хиральных неподвижных фазах или на ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз. В качестве неподвижных фаз могут быть использованы сорбенты с модифицированной поверхностью, содержащей такие вещества как хитозаны, циклодекстрины, полисахариды, белки и др. (селекторы). В качестве подвижных фаз могут быть использованы подвижные фазы с различными добавками (модификаторами): хиральные комплексы металлов, ней тральные хиральные лиганды, ион-парные реагенты.

В частных фармакопей ных статьях должно быть дано подробное описание рекомендуемой хиральной фазы (неподвижной или подвижной) и условий анализа.

Селекторы должны иметь хиральные центры и содержать полярные функциональные группы (-ОН, -NH2, -СООН и др.).

Эффективно разделение на катионных хиральных сорбентах. Хиральное разделение достигается полностью при достаточном количестве хиральных центров, которые иногда вводят даже в боковые цепи селектора.

В газовой хроматографии наиболее эффективное и селективное разделение хиральных соединений наблюдается при использовании капиллярных колонок.

В ряде случаев для повышения селективности или чувствительности метода можно использовать дериватизацию изучаемых образцов.

1.6. Сверхкритическая флюидная хроматография

Cверхкритическим флюидом (или просто флюидом) называется вещество при значениях температуры и давления выше критических (ТС и РС, соответственно). В этом состоянии (сверхкритическом флюидном) свой ства вещества являются промежуточными между свой ствами газа и жидкости. Хроматографический процесс, в котором в качестве подвижной фазы испольpуется флюид, называется сверхкритической флюидной хроматографией (СФХ)

С точки зрения применения флюида в качестве подвижной фазы в хроматографии важны его плотность, коэффициент самодиффузии и вязкость. Плотность основных флюидов, используемых в хроматографии, примерно на 2–3 порядка больше плотности газов и в несколько раз меньше плотности соответствующих жидкостей. Вязкость флюидов примерно на порядок выше вязкости газов и примерно во столько же раз меньше вязкости жидкостей. Это же соотношение справедливо и для коэффициентов самодиффузии. На этом различии свой ств основаны преимущества СФХ по сравнению с ВЭЖХ: – скорости разделения в СФХ значительно выше, чем в ВЭЖХ;

– размывание пиков в СФХ меньше, чем в ВЭЖХ (хотя и больше, чем в ГХ).